細(xì)胞周期碘化丙啶紅色熒光流式細(xì)胞分析試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）
 
主要用途
 
細(xì)胞周期碘化丙啶（）紅色熒光流式細(xì)胞分析試劑是一種旨在通過(guò)細(xì)胞流式儀測(cè)定細(xì)胞中DNA結(jié)合碘化丙啶染料程度，來(lái)定量DNA含量，以進(jìn)一步獲取細(xì)胞周期分布狀況的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲(chóng)等）的細(xì)胞周期分析。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、細(xì)胞分裂、代謝等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，分辨率高，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。
 
技術(shù)背景細(xì)胞周期碘化丙啶紅色熒光流式細(xì)胞分析試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
 
細(xì)胞周期是評(píng)價(jià)細(xì)胞代謝、生理和病理狀況的重要指標(biāo)。通過(guò)DNA結(jié)合染料，借助細(xì)胞流式儀，測(cè)定出DNA含量，根據(jù)DNA含量隨著細(xì)胞周期的不同而發(fā)生變化，來(lái)確定和區(qū)別細(xì)胞周期的不同階段。流式細(xì)胞術(shù)（FLOW CYTOMETRY）是七十年代發(fā)展起來(lái)的集計(jì)算機(jī)、激光、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)為一體的高科學(xué)技術(shù)。凋亡細(xì)胞是在正常G0/G1峰細(xì)胞群前出現(xiàn)亞二倍體峰（sub-G1）細(xì)胞群。
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
清理液（Reagent A）     100毫升
固著液（Reagent B）     100毫升
緩沖液（Reagent C）      50毫升
染色液（Reagent D）    2毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)  1份
 
保存方法細(xì)胞周期碘化丙啶紅色熒光流式細(xì)胞分析試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
 
保存緩沖液（Reagent C）和染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent D）避免光照，有效保證6月
 
用戶(hù)自備
 
HANKS平衡鹽溶液（12022）或PBS緩沖溶液（12033）：用于清洗細(xì)胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離
完全細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于中和胰蛋白酶的處理
15毫升錐形離心管：用于細(xì)胞收集的操作
1.5毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞收集的操作
細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析
 
 細(xì)胞周期碘化丙啶紅色熒光流式細(xì)胞分析試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。移出500微升緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，加入20微升染色液（Reagent D）混勻后標(biāo)記為染色工作液，置于暗室里，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。
 

• 準(zhǔn)備1瓶25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞，鋪滿(mǎn)率達(dá)70％（約1百萬(wàn)細(xì)胞數(shù)）
• 小心移出細(xì)胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管（收集漂浮細(xì)胞）
• 加入2.5毫升用戶(hù)自備的HANKS平衡鹽溶液或PBS緩沖溶液到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
• 小心移出2.5毫升清洗液到上述15毫升錐形離心管
• 加入1毫升胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)平面
• 置入37℃培養(yǎng)箱孵育1分種
• 振動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，然后加入5毫升用戶(hù)自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入到上述15毫升錐形離心管（懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A）到15毫升錐形離心管，混勻
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為500g（或2000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升預(yù)冷的固著液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃冰箱里孵育16小時(shí)
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為500g（或2000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去固著液
• 加入500微升染色工作液，用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細(xì)胞顆粒群
• 在暗室里37℃培養(yǎng)箱里孵育45分鐘
• 移入到細(xì)胞流式儀專(zhuān)用測(cè)試管（可放進(jìn)4℃冰箱里待測(cè)）
• 即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：波長(zhǎng)488nm氬離子激光出現(xiàn)紅色熒光（或488nm激發(fā)波長(zhǎng)，610nm散發(fā)波長(zhǎng)），觀察50000個(gè)細(xì)胞以上

 
注意事項(xiàng)
 

• 本產(chǎn)品為100次操作
• 確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，須收集所有懸浮和貼壁細(xì)胞
• 可用35mm培養(yǎng)皿或6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞總量不得少于30萬(wàn)
• 操作時(shí)，須戴手套
• 孵育時(shí)，必須避免光照
• 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析。如果放進(jìn)4℃冰箱里待測(cè)，不要超過(guò)1周
• 細(xì)胞流式儀分析前，須混勻內(nèi)容物，避免細(xì)胞成團(tuán)
• 細(xì)胞檢測(cè)量不得少于10000個(gè)
• 告知流式儀技術(shù)員有關(guān)細(xì)胞類(lèi)型
• 本公司提供系列細(xì)胞周期分析試劑產(chǎn)品