實時熒光定量PCR：在PCR反應體系中加入熒光基團（探針或染料），利用熒光信號積累實時監測整個PCR反應過程，最后通過Cq或Ct值和標準曲線對起始模板進行絕對定量或相對定量分析。而評估熒光定量PCR反應效果好壞，可以從以下幾個方面來評估：
 

1.擴增效率及相關系數

良好的PCR擴增是指數級的，理論上以100%的效率進行，但實際上并不是所有的PCR反應都表現出相同的高效率，所以需要驗證實際的擴增效率E。當計算評估PCR擴增效率時，至少需要做3次平行重復，并至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度，得到線性方程Cq= -klgX₀+b、擴增效率E=10^(-1/k)-1。并且E在0.9-1.1之間，即擴增效率在90-110%，被認為此擴增接近理想情況；相關系數R²值大于0.98時，說明兩個數值之間相關的可信度很好，可用來計算。
 

▲ 圖1. 5個梯度稀釋液的擴增曲線及標準曲線。

圖源：Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統
 

2.精確度（Precision）

指多個復孔Cq值之間的接近程度，且重復孔之間的標準偏差不大于0.2，說明實驗的重復性較好。

▲ 圖2. 96孔重復的擴增曲線，Cq Mean=19.1，CV=0.002

圖源：Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統
 

3. 重現性（Reproducibility）

指不同批次之間或不同實驗室之間的結果變化，通常通過SD或者CV來評估。

▲ 圖3. 4臺獨立的Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統同時檢測GAPDH，Cq Mean=20.11，SD= 0.002
 

4. 靈敏度（Sensitivity）

通常靈敏度表示為檢測限(limit of detection, LOD)，可通過梯度稀釋樣品來確定最低檢測限。分析靈敏度是指一個樣本可通過實驗精確測量的最小拷貝數。
 

5. 準確度（Accuracy）

指測量值與真實值的接近程度。針對低拷貝樣本，由于受采樣概率的影響，可能會導致結果不準確。為了更可靠地檢測低拷貝，可以增大平行實驗的重復數，來統計顯著性。
 

▲ 圖4. 低拷貝樣本采樣概率符合泊松分布

圖源：網絡，侵刪
 

6. 特異性（Specificity）

指qPCR實驗中只可以檢測到目的基因，引物特異性擴增靶序列，而不會擴增其他基因序列。可通過凝膠電泳檢測擴增產物是否為單一條帶，或通過qPCR反應，根據溶解曲線是否具有單峰來判斷。

▲ 圖5. 溶解曲線單峰

圖源：Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統

通過這六個方面就可以評估實時熒光定量PCR反應效果。你學會了嗎？實驗數據是好是壞快來自檢吧。

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