Fluoro-Gold雙光子成像：實現(xiàn)小鼠腦干神經(jīng)元超深度成像
在神經(jīng)科學研究中，逆行神經(jīng)元追蹤技術(shù)是解析復雜神經(jīng)環(huán)路的關(guān)鍵工具。自19世紀高爾基染色技術(shù)開創(chuàng)神經(jīng)解剖學研究以來，科學家們不斷探索更精準的標記方法。Fluoro-Gold（FG）作為目前最常用的熒光逆行示蹤劑，憑借其高亮度、抗光漂白性及細胞質(zhì)特異性標記能力，成為神經(jīng)環(huán)路研究的“金標準”。然而，傳統(tǒng)寬場熒光顯微技術(shù)受限于軸向分辨率不足，無法實現(xiàn)深層組織的三維成像；而共聚焦顯微鏡因紫外激發(fā)需求與穿透深度限制，難以滿足活體或厚組織樣本的高分辨需求。
雙光子激發(fā)顯微技術(shù)（2PEM）通過近紅外飛秒激光激發(fā)熒光分子，突破了光學穿透深度與空間分辨率的瓶頸，但其在FG成像中的應(yīng)用長期未被系統(tǒng)研究。基于《Scientific Reports》最新研究成果，解析FG的雙光子激發(fā)光譜與熒光壽命特性，揭示其在深層神經(jīng)成像中的突破性應(yīng)用，為神經(jīng)退行性疾病研究與神經(jīng)再生醫(yī)學提供全新視角。
研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
逆行示蹤劑的演進與FG的生物學特性
從早期的辣根過氧化物酶到現(xiàn)代熒光染料，逆行示蹤技術(shù)的發(fā)展始終圍繞提升標記特異性與成像效率。FG的活性成分羥基芪巴脒（OHSA）通過軸突末端攝取并逆行運輸至胞體，在溶酶體中富集形成穩(wěn)定標記。其熒光特性受pH調(diào)控：中性環(huán)境發(fā)射黃色熒光，酸性條件下藍移。這種特性使其在活體與固定組織均能保持高信噪比，但傳統(tǒng)紫外激發(fā)方案限制了其與現(xiàn)代顯微平臺的兼容性。
寬場熒光顯微技術(shù)缺乏光學切片能力，共聚焦顯微鏡雖能實現(xiàn)三維重建，但受限于紫外激光器的稀缺性與組織穿透深度（通常<100 μm）。此外，F(xiàn)G的廣譜發(fā)射特性易與其他熒光標記物（如脂褐素自發(fā)熒光）發(fā)生串擾，導致多色成像困難。如何實現(xiàn)FG標記神經(jīng)元的高分辨率深層成像，并解決光譜重疊問題，成為技術(shù)突破的關(guān)鍵。
技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
雙光子激發(fā)光譜的首次表征
研究團隊通過可調(diào)諧鈦寶石激光器（720-990 nm）系統(tǒng)測量了FG的雙光子激發(fā)光譜。結(jié)果顯示，F(xiàn)G在720 nm處呈現(xiàn)最大激發(fā)效率，與其單光子紫外吸收峰（350 nm）呈近似倍頻關(guān)系。這一發(fā)現(xiàn)填補了FG光學特性的空白，為雙光子成像參數(shù)優(yōu)化提供了直接依據(jù)。值得注意的是，在腦組織背景下，760 nm激發(fā)可最大化FG與自發(fā)熒光的信噪比，提示波長選擇需兼顧組織光學特性。
通過時間相關(guān)單光子計數(shù)技術(shù)，研究者測得FG的熒光壽命呈雙指數(shù)分布：快速衰減組分（<100 ps）與慢速組分（2.3 ns），平均壽命為1.4 ns。相較于脂褐素（1.3 ns），F(xiàn)G的壽命差異雖小，但通過FLIM仍可實現(xiàn)有效分離。這種基于壽命對比的策略，為多標記實驗中消除背景干擾提供了新思路，尤其適用于神經(jīng)退行性疾病研究中病理蛋白共定位分析。
折射率匹配提升成像深度
針對厚組織光散射問題，研究采用甘油浸沒物鏡結(jié)合商用折射率匹配液，使全腦干樣本的成像深度突破450 μm。相較于水浸物鏡（150 μm極限），該方案通過減少球差與光衰減，實現(xiàn)了近乎單細胞分辨率的深層成像。這一技術(shù)路徑為全器官尺度神經(jīng)環(huán)路重建奠定了基礎(chǔ)。
成像實驗與結(jié)果分析
高分辨率三維重建與亞細胞結(jié)構(gòu)解析
在面神經(jīng)運動核標記實驗中，雙光子成像清晰展現(xiàn)了神經(jīng)元胞體、樹突及胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)。相較于寬場成像的模糊輪廓，2PEM可分辨直徑<1 μm的樹突棘，為突觸可塑性研究提供形態(tài)學量化基礎(chǔ)。通過機器學習驅(qū)動的三維分割算法，研究者實現(xiàn)了自動化的細胞計數(shù)與空間分布統(tǒng)計，效率較傳統(tǒng)切片法提升十倍以上。
研究進一步將FG與FR分別標記面神經(jīng)不同分支，成功區(qū)分相鄰運動亞核的投射特異性。結(jié)合FLIM技術(shù)，雙光子平臺可同步解析多色標記信號，為神經(jīng)環(huán)路拓撲圖譜繪制提供工具。此外，F(xiàn)G與免疫組化及組織透明化技術(shù)的兼容性（如CLARITY），預(yù)示其在跨尺度成像中的廣泛應(yīng)用潛力。
總結(jié)與展望
FG的雙光子特性表征標志著神經(jīng)成像技術(shù)的重要突破。通過優(yōu)化激發(fā)波長（720 nm）與折射率匹配方案，研究者實現(xiàn)了哺乳動物全腦干尺度的高分辨三維成像，并結(jié)合FLIM技術(shù)解決了復雜生物樣本中的信號串擾問題。這些進展不僅提升了逆行示蹤實驗的效率和精度，更為神經(jīng)再生、疼痛環(huán)路解析及退行性疾病機制研究開辟了新路徑。隨著雙光子顯微系統(tǒng)的小型化與高通量化，此類技術(shù)有望從基礎(chǔ)研究走向臨床病理診斷，例如術(shù)中神經(jīng)束定位或神經(jīng)移植效果評估。
聲明：本文僅用作學術(shù)目的。
Miller MQ, Hernández IC, Chacko JV, Minderler S, Jowett N. Two-photon excitation fluorescent spectral and decay properties of retrograde neuronal tracer Fluoro-Gold. Sci Rep. 2021 Sep 10;11(1):18053.
DOI:10.1038/s41598-021-97562-3.
