BIACORE3000操作手冊
本手冊包括BIACORE3000工作原理，實驗步驟，操作規(guī)程，注意事項等。

BIA是基于表面等離子體共振（SPR）技術(shù)來實時跟蹤生物分子間的相互作用，而不用任何標(biāo)記物的技術(shù)。表面等離子體子共振(surface plasmon resonance , SPR)是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。在發(fā)生全反射的界面涂上一薄層金膜（或其它金屬膜）約50nm厚，由于金膜中有自由電子，它們并不是靜止不動而是不停在平衡位置附近振動，并具有一定的頻率。當(dāng)光由另一側(cè)以大于臨界角入射有金膜的界面，由于入射光會在界面方向有一分量，當(dāng)這一分量與金膜中電子振蕩頻率相同時，兩種能量會發(fā)生整合，使在某個角度上發(fā)射光能量降低，這個能量降低的角度成為SPR角。當(dāng)緊靠在金屬薄膜表面的介質(zhì)折射率不同時,SPR角的位置將不同，根據(jù)SPR角的變化可以推斷所發(fā)生的變化。

BIA是英語“Biomolecular Interaction Analysis”的縮寫，BIA提供了實時觀察生物分子間相互作用的技術(shù)。通過它能觀察兩種分子結(jié)合的特異性，能知道兩種分子的結(jié)合有多強，還能了解生物分子的結(jié)合過程共有多少個協(xié)同者和參與者。BIA可以讓得到用其他技術(shù)方法難以得到的結(jié)果，因為它可以實時反映分子結(jié)合過程中每一秒變化的情況。無需借助標(biāo)記物進行分析使BIA廣泛應(yīng)用于各類生物體系的測定，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細胞。BIA就是利用金屬薄膜表面的折射率的改變，引起共振角的變化，來推斷金屬薄膜表面的變化。實驗時先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，將與之相互作用的分子溶于溶液流過芯片表面。檢測器能跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面分子的結(jié)合、解離整個過程的變化。

BIA技術(shù)應(yīng)用的領(lǐng)域主要有四個方面：
1、動力學(xué)常數(shù)的測定2、測定樣品濃度3、分析相互作用模式4、復(fù)合物功能分析

一、 動力學(xué)常數(shù)的測定通過實時監(jiān)測結(jié)合在芯片表面分子質(zhì)量的變化，可以得到兩個分子之間的結(jié)合與解離常數(shù)。由于檢測的是芯片表面質(zhì)量的變化，所以大分子的分析物相互較容易得到較強的信號，但是對于小分子的分析物可以通過優(yōu)化實驗設(shè)計而進行檢測。BIA可以用來分析不同抗體與抗原的結(jié)合與解離常數(shù)，相對與以前其它檢測抗體效價的方法，BIA不僅快速，可以準(zhǔn)確定量，和可以讓你看到整個結(jié)合和解離的動態(tài)過程。

二、濃度的測量如果簡單地測量一個純物質(zhì)的濃度，有很多方法可以選擇。但是如果想知道，某種復(fù)合物中其中一個組分的濃度，則很難實現(xiàn)。用BIA技術(shù)可以很輕松做到這一點。先將待測物的抗體耦聯(lián)到芯片表面，再將一系列不同濃度的標(biāo)樣流過芯片，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，此時將混合物流過芯片，根據(jù)信號強度大小就可以得到原混合物中某組分的濃度。如果待測物很小，可以采取競爭的方法實現(xiàn)。

三、分子相互作用模式的研究我們想知道兩分子之間相互作用的比例，結(jié)合位點，抗原決定族的位點，都可以用BIA來完成。研究突變后活力大小的變化，研究復(fù)合物形成次序等等。

四、蛋白質(zhì)功能分析復(fù)合物的組裝可以看成研究蛋白功能的一個例子。也可以設(shè)計其它的一些實驗，只要前后芯片表面的質(zhì)量有變化就可以利用BIA技術(shù)來檢測。

四、實驗步驟
1、 preconcentration （預(yù)結(jié)合試驗）
由于芯片表面帶有負(fù)電，因此要偶聯(lián)到芯片上的分子必須帶上正電，才有利于分子吸附到芯片表面，以利于共價偶聯(lián)反應(yīng)的完成。預(yù)結(jié)合實驗就是將樣品溶解在不同PH值的緩沖液中，使其帶上不同量的電荷。然后，將樣品流過芯片表面，觀察它與芯片的結(jié)合曲線，就可判斷出合適的條件。如下圖：兩種不同條件下的吸附實驗，第一個峰表明在該條件下，吸附很快達到飽和，這樣吸附的量有限，第二種一直呈上升趨勢，有利于在芯片上偶聯(lián)較多的蛋白。實際工作中，還會碰到各種不同的吸附曲線，需要根據(jù)實際情況來判斷最佳條件。 將抗體用不同PH值得buffer稀釋10－40倍，以5μl/min的流速流過芯片表面，觀察抗體與芯片的吸附結(jié)果。

2、 偶聯(lián)
a) 取100μlNHS和100微升EDC混合，12000rpm離心5分鐘；
b) 取一定體積的偶聯(lián)蛋白，按預(yù)結(jié)合的比例稀釋，稀釋后需要150μl，取100μl ethanolamineHCL。以上試劑平衡到室溫25攝氏度左右，高速離心五分鐘；
c) 將上述三種試劑放在樣品架上，設(shè)定加樣流速為10μl/min，inject方式進樣，NHS/EDC,樣品，ethanolamine-HCl分別上樣100，100，和60μl。
d)結(jié)束即可得到類似下圖的曲線。

3、 結(jié)合
將抗原用合適的緩沖液稀釋成適當(dāng)濃度，離心后上樣，觀察抗原抗體結(jié)合過程。
如果需要測量不同條件下的結(jié)合狀況，可以在一次進樣結(jié)束之后，對芯片進行再生。然后再上下一個樣品。
4、 芯片再生
抗原抗體結(jié)合的再生條件比較簡單，簡單地用PH2.5的10mMglycine沖洗就可以了。但實際工作中，如果偶聯(lián)的是蛋白，往往情況要復(fù)雜得多。首先,再生條件要能將結(jié)合物從芯片上去掉，其次不能讓結(jié)合在芯片上的蛋白變性失活。因為，萬一所選條件使芯片上偶聯(lián)的蛋白失活，這個通道就意味著報廢。所以，芯片的再生是所有用戶面臨的一個比較頭疼的問題。芯片再生要求再生之后，不僅要求基線要能回復(fù)到初始值，還要求再上相同的樣品，結(jié)合能力不會出現(xiàn)明顯下降。

5、 如果需要得到結(jié)合與解離的動力學(xué)常數(shù)，至少需要進行五組不同濃度的結(jié)合實驗。

6、 分析實驗結(jié)果，打印實驗報告。

7、 儀器維護，實驗完畢，running
buffer換成過濾并脫氣的超純水或HES－EP緩沖液。芯片更換為維護芯片，進行至少兩遍prime后，運行standby。

8、 收拾整理實驗場所。

附錄
BIAcore 3000生物分子相互作用分析儀
BIAcore系統(tǒng)的3個核心部分是傳感器芯片，SPR光學(xué)檢測系統(tǒng)，微射流卡盤。

傳感器芯片
傳感器芯片是實時信號的傳導(dǎo)載體。芯片是在玻璃片上覆蓋了一層金膜，在金膜的表面連有不同的多聚物以形成不同的表面環(huán)境，以利于固定不同性質(zhì)的生物分子。每個芯片表面有4個通道（FC），可以獨立做4個不同的實驗，也可以做實時的對照實驗。

SPR光學(xué)檢測系統(tǒng)
BIA技術(shù)是基于一種表面等離子共振（SPR）的物理光學(xué)現(xiàn)象的生物傳感分析技術(shù)。不必使用熒光標(biāo)記和同位素標(biāo)記，從而保持了生物分子的天然活性。當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同透明介質(zhì)的界面時將產(chǎn)生全反射，且反射光強度在各個角度上都應(yīng)相同，但若在介質(zhì)表面鍍上一層金屬薄膜后，由于入射光可以引起金屬中自由電子的共振，從而導(dǎo)致反射光在一定的角度內(nèi)大大減弱，其中使反射光完全消失的角度稱為共振角。共振角會隨金屬薄膜表面通過的液相的折射率的改變而改變，折射率的變化（RU）又和結(jié)合在金屬表面的大分子質(zhì)量稱正比。因此，BIA技術(shù)可以通過對反應(yīng)全過程中各種分子反射光的吸收獲得初始的數(shù)據(jù)，并經(jīng)相關(guān)處理獲得結(jié)果－傳感圖。

微射流卡盤
微射流卡盤是一個液體傳送系統(tǒng)，通過軟件的控制自動地傳送一定體積的樣品至傳感器芯片表面的不同通道。甚至自動進行樣品的回收。
今天對生命科學(xué)奧秘的探索，已經(jīng)不僅僅停留在是什么，而是要探詢?yōu)槭裁�。旨在揭示生命現(xiàn)象背后的機理研究，必然要理清生物分子間復(fù)雜的關(guān)系。只有Biacore能實時反映生物分子相互作用的整個過程，而不同于其他只能提供生物分子作用后的結(jié)果的方法，為您開辟一個嶄新的研究角度。

BIA目前應(yīng)用的領(lǐng)域有：
- 蛋白質(zhì)組學(xué)研究（Proteomics）
- 癌癥研究 (Cancer Research)
- 新藥研發(fā) (Drug Discovery)
- 信號傳遞 (Cell Signalling)
- 多分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和組裝 ( Multi-molecular Complexes)
- 分子識別（Molecular Recognition）
- 免疫調(diào)節(jié) (Immune Regulation)
- 免疫測定法 （Immunoassay）
- 疫苗開發(fā) （Vaccine Development）
- 瞬時結(jié)合（Transient Binding）
- 配體垂釣 (Ligand Fishing)
- 結(jié)合特異性 （Binding Specificity）
- 結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 （Structure-function Relationship）
- 酶反應(yīng)（Enzyme Reaction）

樣品類型
小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、寡聚糖、類脂、噬菌體、病毒和細胞

操作流程
一、樣品準(zhǔn)備
樣品包括耦聯(lián)到芯片表面的分子（ligand）和在溶液中流過的樣品，稱作analyte。如果ligand是小分子，要檢查該分子結(jié)構(gòu)上是否有可供耦聯(lián)的俄基團，如果沒有需要考慮對分子進行修飾。
二、緩沖液準(zhǔn)備
該實驗要求所有緩沖液都經(jīng)過過濾和脫氣處理。如果緩沖液能夠耐受高溫的話，可以對緩沖液進行滅菌處理。這樣滅菌有脫氣的效果，同時也能保存更長的時間。
三、耦聯(lián) 參照耦聯(lián)的具體方法。
四、測試 將分析物用合適的緩沖液稀釋處理，上樣。要盡可能讓樣品緩沖液與系統(tǒng)載流緩沖液一致，
五、再生 再生是指將結(jié)合到芯片表面的分析物洗脫掉，以便芯片的重復(fù)使用。

日常維護
1、 每周要進行一次DESORB
2、 緩沖液要每天檢查，脫氣處理；

來源：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)實驗中心