為了滿足針對耐藥性微生物治療不斷增長的需求，開發出了基于競爭的自適應進化篩選方法。這種方法存在的一個難題就是如何從一個多樣性的微生物克隆庫中找到高價值的菌株，篩選到適合下游藥物開發，能夠產生新型抗生素的最好候選菌株。

 

對于從克隆庫中篩選抗生素產生菌株來說，通常使用瓊脂平板抑菌圈或透明圈篩選法。具有抗性的克隆可以產生并分泌對平板微生物具有抑制作用的代謝產物，因此在克隆周圍產生了透明圈，根據透明圈的大小可以準確地從克隆庫中篩選出這些菌株。透明圈的直徑和抗性代謝產物產量一般成正比例關系。因此，高價值的菌株通常產生直徑最大的透明圈。這些克隆被篩選出來用于進一步的特性研究和藥物開發。

 

如果使用人工篩選并挑取產生抑菌圈的克隆，整個過程不但慢、煩瑣，而且易出錯。為了解決這些問題，Molecular Devices開發出了QPix400系列微生物克隆篩選系統，提供了高通量自動化克隆篩選和挑取平臺，具有無與倫比的性能和效率。這里我們詳細描述了如何使用這個系統以及軟件模塊客觀篩選并挑取高價值的透明圈產生菌株。

 

·適用于各種適應性進化方面的應用

·加快新型耐藥菌株感染治療方法的開發速度

·用戶自定義軟件參數，發現獨特的生物學特性

·通過可靠的自動化解決方案篩選高價值克隆

 

Streptomyces clavuligerus可以產生超過20種具有生物活性的次級代謝產物。包括許多B-內酰胺類抗生素，如cephamycin C、cephalosporin C、clavulanic acid等。這里使用Streptomyces clavuligerus(ATCC 27064)作為模式生物，演示針對E.coli (Migula, Castellani and Chalmers ATCC 47076)的抑菌圈的識別和挑取。兩個菌株都從ATCC獲得，使用TSB培養基進行培養。液體培養階段使用搖床培養1-3天，相應的S. clavuligerus在30℃，E.coli在37℃培養。S. clavuligerus經過培養后，稀釋培養液OD600值在0.10-0.13之間，取2ul培養液點到TSA瓊脂板上，28℃培養3-5天。S.clavuligerus在TSA平板生長后，經過稀釋的E.coli培養液被均勻地涂布到平板上，確保E.coli完全環繞并接觸到每個S.clavuligerus克隆。平板28℃繼續培養1 - 2 天， 并每天觀察。如圖1 所示，S.clavuligerus克隆產生針對E.coli的抑菌圈。

 

 

使用QPix400系統的抑菌圈識別軟件模塊對平板進行白光成像，如圖2所示，軟件識別具有透明圈的克隆。高級的軟件算法應許用戶自定義篩選參數，篩選并挑取符合特定要求的抑菌圈，如克隆大小、抑菌圈直徑、克隆直徑、軸比以及克隆邊緣形狀等（圖2）。

 

 

接下來，軟件選擇的可以產生抑菌圈的克隆以縮略圖的形式排列。克隆可以以多種順序進行排列，比如總的透明區域大小、克隆大小、軸比、邊緣形狀等（圖3）。軟件自動列出了每個產生抑菌圈克隆的詳細定量數據，方便隨時查看。

 

 

 

為了進一步驗證基于克隆庫或者自適應進化的自動抑菌圈識別和篩選方法的效果，篩選了點有多樣微生物克隆庫的QTrays培養板。專用的軟件模塊從QTray上長出的48個克隆中準確篩選出了3個產生抑菌圈的克隆(如圖4)。這種方法可以實現高通量有目的性地從一個大的微生物克隆庫中篩選、識別和挑取產生透明圈的克隆。

 

 

市場需要不斷開發出新型抗生素用于治療耐藥菌感染引起的疾病。為了開發新型抗生素或者微調抗生素的生物合成途徑，國內外科研人員付出了許多的努力。基于克隆庫篩選或者基于競爭性自適應進化都可以用于產生廣譜抗生素過量產生菌株。

 

使用QPix400系列微生物克隆篩選系統以及QPix抑菌圈軟件識別模塊，我們可以輕松并且可靠地進行高通量篩選透明圈產生克隆。這個自動化的篩選方法將大大增加我們尋找新型抗生素的能力，用于應對已有的或者新出現的抗生素耐藥菌引起的疾病。