CyTOF和細胞Barcode技術在干細胞研究領域中的應用
“每個細胞都有太多我想知道的東西， 我一直都在試圖檢測更多的轉錄因子、更多的信號通路分子、更多的表面Marker以及更多的樣本——而且最好是同時檢測它們，這真是干細胞研究者的夢想。”
——斯坦福大學干細胞生物學，Eli Zunder博士。
現在，昔日的夢想已經成為了現實中Zunder的日常工作。幾年前，Zunder有幸得以在斯坦福大學Garry Nolan教授的實驗室中工作，該實驗室是最早使用質譜流式技術的實驗室之一，很早就開始利用質譜流式系統在單細胞水平進行生理、疾病等狀態下的細胞功能研究。
從2009年問世以來，質譜流式技術已經幫助研究人員探索了細胞生物學、免疫學以及疾病發生過程中的諸多基本問題。Nolan實驗室不僅為Zunder提供了強大的技術支持，還提供了兼容創造性和嚴謹性的科研環境，這使得Zunder可以自由的開發新技術，用來開展一些直到最近還被認為是“不可能”的科學研究。
Zunder的日常工作之一是iPSC（誘導多能干細胞）重編程早期階段的分子機制研究。在這些研究中，單細胞分析是至關重要的，因為在一個重編程培養物中，只有一小部分細胞可以成功的達到iPSC的終末狀態。Zunder解釋道，問題的關鍵在于觀察誘導培養過程中細胞群體的變化，檢測細胞表面和內部活動，然后把這些變化記錄下來，找出誘導過程中細胞可能采取的重編程策略。為了完成對細胞諸多參數進行同時檢測，Zunder需要借助于質譜流式技術，除此以外，還有另一項他自己技術創新。
細胞Barcode技術使得不同本合并在一起進行標記、檢測、分析成為可能
在其他工作人員的幫助下，Zunder優化了基于金屬標簽的“細胞Barcorde”（Mass-tag cell barcording）技術。“細胞Barcorde”讓不同樣本的細胞帶上不同的金屬標簽，使研究者可以將多個樣本混合為一管分析，簡化了樣本制備的操作的同時，也消除了由于染色和數據收集過程中產生的誤差。這樣做不僅節約了時間，也使研究者獲得更精確的數據，這一點在Zunder開展的這種大型實驗項目中顯得尤其重要。
當時，Barcorde技術還沒有應用于質譜流式領域中，Zunder已經豐富的熒光流式的Barcorde技術經驗。采用一種非冗余的二元編碼策略，使用鑭系金屬做為標簽，他和同事Bodenmiller一起將這項技術應用于質譜流式。
新的基于鈀元素元素的Barcorde方案
最近，Zunder對Protocol進行改進，利用鈀元素的六個沒有放射性的穩定同位素實現對樣本進行Barcorde。新的Protocol采用了部分冗余的三元編碼方式，研究人員可以根據結果剔除不同樣本細胞間形成的二聚體。此外，它還配備有半自動化的debarcorde算法，方便數據的分析。這些改進不僅增加了可用的檢測通道，也改進了數據的精確度，使研究者可以利用質譜流式探索更多新的科學問題。
利用細胞Barcorde技術，Zunder利用一次實驗就可以探索整個生物系統對多重刺激的反應。他可以同時測量細胞重編程過程中近乎無限的數據點，檢測的參數包括細胞內信號通路、轉錄因子網絡以及細胞表面Marker等。通過分析這些數據Zunder找到了重編程過程中可以做為“路標”的蛋白分子，把這些“路標”和其對應的時間點相聯系，就能以空前的精細度展現細胞群體隨時間的變化。基于此，Zunder發現了細胞重編程過程中一個重要的早期中間階段。
Zunder利用質譜流式描繪的iPSC重編程“路線圖”
“Barcorde的方法非常有用，因為我們可以把在實驗中收集所有的樣品合并在一起檢測，” Zunder解釋說，“我們可以非常自信的說，在細胞群體中看到的任何變化，都不是樣本間的偶然誤差。這一點特別重要，尤其是對表達水平相差微小的樣本進行分析的時候。”
上文提到的debarcode算法，是與Nolan實驗室的同事Rache Finck合作開發的，這個算法可以將采集到的Barcorde數據轉化為對應于原始樣品的獨立文件。半自動化的算法提供了一個快速、準確、重現性好的解碼方法，讓研究人員繞過的繁瑣和主觀的手工設門過程。
在探索性實驗中，研究人員需要將單細胞數據和細胞二聚體區分開來，這一點非常重要。Zunder要尋找的是細胞群體隨時間的發生的變化，他不想把一個細胞二聚體當成一個沒有報道過的新細胞類型。哥倫比亞大學的Dana Pe’er提出了Hamming 編碼的想法，這啟發了Zunder，他對原來的技術進行了改進，使用了冗余編碼體系，這可以幫助他非常容易的剔除近100%的二聚體數據。
細胞Barcorde技術可以很容易的整合到任何單細胞分析的工作流程。“我們在干細胞的研究中面臨的挑戰同樣適用于其他生物系統的研究，所以Cytof也可以在這些領域發揮類似的功能。”Zunder注意到，“在復雜生物系統的研究中，可以測試的實驗條件數量幾乎是無限的，你可以考慮不同的處理時間、不同的藥物濃度、不同的條件組合，通過對比，你可以掌握你所研究的生物系統究竟是如何運作的。”將質譜流式和細胞Barcorde技術相結合，使得研究者可以自由的獲得近乎無限的數據，極大的加快了研究進程。
Barcorde技術的這些優點使其在Zunder工作中不可或缺。“現在這已經是標準的做法，”他說，“在我們的實驗室，不論誰跑Cytof樣品，都會對樣本進行barcorde。”
在2015年初，Zunder和他的團隊在Nature Protocols（Vol. 10, No. 2）雜志上分享這一技術。經過斯坦福大學的授權，Fluidigm公司進行了大量的標準化和測試工作，推出了Zunder protocol的商業版本以及Barcorde試劑目錄，目前質譜流式的客戶都可以方便的使用。
細胞Barcorde和數據的Debarcorde已經成為CyTOF實驗流程的重要組成部分
對于這一產品的推出，Zunder非常高興。當初他和同事一起使用Barcorde標記時，需要冒各種風險，當出現問題時，需要根據結果調整實驗方案。“在一開始優化Barcorde實驗方案和試劑時，我們需要仔細的排查問題原因、測試體系的重復性。”現在只需要有Fluidigm的標記試劑盒，任何質譜流式實驗室都可以直接使用該技術，而不需要重復他們艱苦的優化過程。
在Zunder看來，質譜流式和細胞Barcorde技術在干細胞生物學領域取得的發現令人振奮，未來還將進一步推進干細胞治療以及再生醫學的發展。“每個人都知道單細胞分析是我們需要的，但是相關技術并不總是那么容易獲得或者使用，”Zunder回憶道，“實際上，在CyTOF和細胞Barcorde技術出現前，我想做的實驗都是不可能的。”
