生物制藥領域如單克隆抗體（mAb），雙特異性抗體，抗體偶聯藥物（ADCs），寡核苷酸，多肽等，質譜技術已經廣泛應用于藥物發現，藥物開發，藥代動力學研究和臨床藥物試驗，藥品QA/QC的全過程，用于高效表征生物分子的結構和功能。

生物制藥的開發和生產過程非常復雜，即使微量雜質如糖基化及電荷異質性等屬性的變化，也會對最終產品的安全性和功效產生重要的影響。傳統方法通常需要多種分析技術來評估生物制藥產品的所有屬性，但其必然帶來更多時間和資源的支出。MAM（多屬性方法學）是一種基于肽圖分離與高分辨質譜聯用的正交方法，旨在實現單個LC-MS實驗來取代多個傳統的QC放行和穩定性測試方法。近年來，MAM已被生物治療行業和監管領導者廣泛接受。大型生物制藥公司正在進行大量投資，以建立MAM工作流程，以證明其生物治療藥物的開發和生產。

通常，生物治療藥物生產過程中所得樣品性質各異，對后續的分析來講存在較高的挑戰。本文將介紹一種全自動的MAM工作流程，可以成功去除干擾物如鹽、表面活性劑、賦形劑、染料等，可以應用于從生物反應器到最終產品的各個階段。

樣品制備及試劑

將48份100ug NISTmAb RM 8671樣品分別溶解于5%SDS，50mM TCEP pH 7.55至終濃度為2ug/uL。其中12份樣品分別加入8ug SILu^TM MAB重標的抗體。洗脫之后，將樣品進行氮吹，之后加入200ul流動相A溶液（含24fmol/ul Pierce ^TM肽段）進行重懸。
 

基于S-Trap^TM試劑盒的全自動MAM工作流程—

Tecan Freedom EVO及Resolvex A200

液體處理工作站Freedom EVO 150整合

Resolvex A200
 

LC-MS/MS方法

• 色譜柱: Avantor ACE 3 C18-300 2.1x50mm

• 流動相A：0.1%甲酸水

• 流動相B：0.1%甲酸乙腈

• 柱溫：+40°C

• 進樣體積：2μl

• 液相流速：500 μl/ml

• 質譜：SCIEX ZenoTOF 7600

• 離子源：Turbo IonSpray

• 掃描方式：Positive TOFMS

• IonSpray Voltage: 5500 V

• Turbo Heater Temperature: +500 °C

• MS1 acquisition mass range (m/z): 300-1500

• Accumulation time (s): 0.25

• 去簇電壓(V): 80

• 碰撞電壓(V): 10

• 所得LC-MS譜圖如下所示，所有譜圖的保留時間偏移在可接受范圍內，相鄰空白的譜圖無肽段檢出，表明無交叉污染，綜合表明此蛋白酶解、脫鹽的實驗流程可靠。
   

 

• 為驗證此方法的重復性，分別選擇NISTmAb RM 8671，SILuMAB^TM和Pierce^TM肽的代表性肽段及其雙電荷離子，計算其峰面積及CVs。結果表明，所有肽段的CV值≤20%，這其中還包括由LC-MS引入的分析誤差，結果具有高度重復性。
   

 

• 通過其他質譜儀如Agilent 6546，獲得了一些數據如下圖，顯示此方法的肽段覆蓋率在99%-100%，以及一些預期的糖基化、二硫鍵、氧化和脫酰胺等。此外，通過Bruker TimsTOF分析鑒定出超過100種宿主細胞蛋白（HCPs），這些HCPs來源于生產mAb RM8671的鼠細胞系。
   

 

• 此方法的去污能力強。采用S-Trap處理后，從下圖可見該方法可明顯去除去污劑，PEG等其他干擾物。
   

總結

該自動化MAM工作流程，具有可重復性，且通量高，單次可處理96個樣品；一次樣品前處理，即可輕松監測多個質量屬性；可以有效的節約樣品前處理時間；全流程自動化，可減少人為引入誤差，亦方便方法轉移。

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