介紹: 
核心實驗室在提供與廣泛的客戶、樣本類型和測序方法相關的各種下一代測序(NGS) 服務時，必須平衡好其 NGS 工作流程的效率與他們生成的數據的質量。隨著測序成本的下降，與文庫制備相關的費用開始成為整個 NGS 工作流程成本的大頭。為了解決測序中的這一主要費用問題，許多機構跟隨了反應小型化的趨勢，有效地將反應體積減少到制造商推薦體積的 10%。

本應用說明重點介紹了即使在低細胞輸入的情況下也能通過精確的正排量微流控試劑分配生成高質量 NGS 文庫的工作流程。四分之一體積的 Illumina Nextera XT 文庫制備的質量控制數據展示了反應小型化在單細胞測序背景下的適用性和有效性。

材料: 

• Eppendorf twin.tec 384 板 (PN 0030129342)

• Illumina Nextera XT DNA 文庫制備試劑盒 (PN FC-131-1096)

• Illumina Nextera XT 索引試劑盒 V2 (FC-131-2001)

• 熱循環(huán)儀

• FORMULATRIX® MANTIS® 液體處理器 (PN MANTV3.2)

• Alpaqua 384 柱式磁板 (PN A001222)

• ThermoFisher Qubit 4 熒光計 (PN Q33226)

• Agilent 2100 Bioanalyzer (PN G2939BA)

方法: 
四分之一體積的 Illumina Nextera XT 文庫制備
在該試點項目中使用了 8 個小鼠神經元細胞 cDNA 樣本（3 種細胞類型；1 ng 的input DNA ），然后通過以下實驗方案評估以四分之一體積產生的文庫的質量：

A. Tagment cDNA – 總反應體積為6.35 µL 

1. 在 384 孔微孔板的孔中加入 1.25 µL input DNA。

2. 將 TD 緩沖液吸入 200 µL 移液器吸頭*，并置于 MANTIS 的 LV 芯片上。將 2.5μL 的 TD 緩沖液分配到MANTIS微孔板上含有樣品的每個孔中。

3.混合。

4. 將 ATM 吸到 200 µL 移液器吸頭*中，然后置于 MANTIS 的 LV 芯片上。將 1.3μL 的 ATM 分配到MANTIS微孔板上含有樣品的每個孔中。

5. 混合。

6.熱循環(huán):

    i. 55℃下保持5 分鐘

    ii. 之后一直保持10℃

7. 將 NT 緩沖液吸入 200 µL 移液器吸頭*，并置于 MANTIS 的 LV 芯片上。將 1.3µL 的 NT 緩沖液分配到MANTIS微孔板上含有樣品的每個孔中。

8.混合。

9.室溫培養(yǎng) 5 分鐘。

B. 文庫擴增– 12.65 µL 總反應體積

1. 將 NPM 吸入 200 µL 移液器吸頭*，并置于 MANTIS 的 LV 芯片上。將 3.8 µL 分配到MANTIS微孔板上含有樣品的每個孔中。

2. 手動移取 1.25 µL 兩種index primer置于樣品中，以便每個樣品獲得獨特的index primer組合。

3. 混合。

4. 熱循環(huán):

   i. 72℃下3分鐘

   ii. 95℃ 下30秒

   iii. 以下做12 次循環(huán)

         a. 95℃下 10 秒

         b. 55℃ 下 30 秒

         c. 72℃ 下 30 秒

   iv. 72℃下5 分鐘

   v. 一直保持10℃

C. 文庫清理

1.將 AMpure XP 微珠吸入 200 µL 移液器吸頭*，然后置于 MANTIS 的 HV 芯片上。將10 µL 分配到MANTIS微孔板上含有樣品的每個孔中。

2.混合。

3.室溫培養(yǎng)5分鐘

4.將微孔板放在磁上，等待 2 分鐘

5.手動去除所有上清液（在第 11 步之前不要從磁上取下微孔板）

6.在 MANTIS 上使用持續(xù)流功能選項，將 50 µL 80% EtOH 添加到微孔板上含有樣品的每個孔中。

7.培養(yǎng)30秒。

8.手動去除所有上清液，同時將微孔板置于磁上。

9.重復步驟 6-8。

10. 風干 15 分鐘。

11. 從磁上取下微孔板。

12. 將 RSB 吸到 200 µL 移液器吸頭*中，然后放在 MANTIS 上的 HV 芯片上。

13. 分配15 µL至MANTIS微孔板上含有樣品的每個孔中。

14. 混合。

15. 在室溫下培養(yǎng) 2 分鐘。

16. 將微孔板放在磁上。

17. 培養(yǎng) 2 分鐘。

18. 手動將 12.5 µL 從微珠轉移到新微孔板上。

D. 吸入量 = 每個樣品的分配量 x 樣品數量 + 10% 安全系數。 當吸入量大于 200 µL 時，請使用 1000 µL 移液器吸頭。

結果: 
通過 Agilent BioAnalyzer 的追蹤評估每個樣品的 Nextera 文庫質量。

圖 1. 從 8 個獨特的 1ng 鼠神經元細胞 cDNA 樣本制備的 8 個下一代測序文庫的 Bio nalyzer 追蹤

總結: 
根據BioAnalyzer 數據追蹤，通過四分之一體積反應小型化制備的文庫組成是可以接受的，并且與按照全體積實驗方案制備的文庫組成相當。

以四分之一體積制備文庫可顯著節(jié)省每次反應試劑盒成本的 75%。 FORMULATRIX® 的MANTIS® 液體處理器通過以低至 100 nL 的體積進行精確的微流控試劑分配，促進反應小型化，并且無耗材、使用簡單且可靠。