分枝桿菌是一大類細菌，廣泛存在于自然環境中。其中一些種類會導致人類患上嚴重疾病，是傳染病感染中的主要死亡原因。臨床上結核分枝桿菌（MTB）和牛分枝桿菌（MB）是導致人類結核病（TB）的主要原因；鳥分枝桿菌（MAV）和細胞內分枝桿菌（MI）是導致人類肺部疾病的常見原因。非結核桿菌和人類結核桿菌感染后的癥狀相識，極易導致誤診。所以需要準確的物種鑒養，輔助制定有效的結核病和非結合桿菌感染的治療策略。細菌培養仍然是鑒定分支桿菌感染的金標準方法，培養周期漫長，需要約6周左右的時間。因此，需要開發精準快速的鑒定方法至關重要。
 

發表在Clinica Chimica Acta的一篇文章中通過基于RPA結合CRISPR-Cas12a的等溫擴增技術，準確鑒定臨床分離株中的8種分枝桿菌菌株；對各種靶向分枝桿菌的檢測限為1-100拷貝/反應，特異性和靈敏度高；反應速度快，一個小時內可以獲得結果；快速、便攜且用戶友好，非常適合資源匱乏的臨床環境。

工作示意圖：步驟包括（1）使用RPA反應擴增部分rpoB基因（2）用Cas12a切割靶DNA，然后反式切割熒光團-淬滅劑ssDNA-報告基因，（3）通過藍/白光透射儀觀察釋放的熒光信號，肉眼可見。

材料和方法

(1)細菌菌株和臨床樣品的制備：提取8個參考菌株DNA 和熱滅活分枝桿菌，包括結核分枝桿菌菌株 ATCC27294、牛分枝桿菌菌株 ATCC19210、膿腫分枝桿菌 ATCC19977、鳥分枝桿菌菌株 ATCC700898、偶發分枝桿菌菌株 ATCC6841、堪薩斯分枝桿菌菌株 ATCC12478、戈登分枝桿菌菌株 ATCC14470、細胞內分枝桿菌菌株 ATCC13950 和共 80 個臨床分離株。小量制備試劑盒提取和純化 DNA。

(2)靶向基因引物和gRNA設計：從ATCC和 NCBI 獲得來自每個分枝桿菌物種的 rpoB 基因核苷酸序。設計靶向 rpoB 基因的 RPA 引物并進行比對。試劑盒制備gRNA。

(3)重組酶聚合酶擴增 （RPA）：使用 TwistAmp Basic 試劑盒（TwistDx，UK）。總體積為 10 μL 、含有 5.9 μL 含凍干反應的再水化緩沖液、0.48 μL 10 μM 正向和反向引物以及 2.14 μL 蒸餾水。然后，加入 1 μL 基因組 DNA 模板和 0.5 μL 280 mM MgOAC，然后在 39 °C 下孵育 30 分鐘，然后在 75 °C 下熱滅活 5 分鐘。蒸餾水用作 NTC（無模板對照）。

(4)CRISPR-Cas12a 檢測方法：1.5 μL 500 nM gRNA、0.75 μL 330 nM  SrCas12a、1 μL 6 μM 熒光團淬滅基團報告基因（FQ 報告基因）（6FAM-AGGACCCGTATTCCCA-BHQ1）、1.5 μL 10x NEBuffer 2.0 反應緩沖液和 1 μL RPA 產物。用蒸餾水將總體積調節至 15 μL。將反應物在 39 °C 下孵育 15 分鐘。使用 BluPAD Dual LED 藍/白光透射儀 （BIO-HELIX，臺灣） 觀察熒光信號。使用智能手機相機捕獲熒光讀數，并使用 ImageJ（NIH，美國）自動調整。對于熒光定量，通過 Applied Biosystems™ QuantStudio™ qPCR Systems（Thermo Fisher Scientific，美國）測量熒光。每個實驗重復 3 次。

(5)評估特異性并確定參考菌株的檢測限:通過對 7 種分枝桿菌屬的交叉反應性測試來評估 gRNA 的特異性。檢測限 （LOD） 一式三份，將每個標準 DNA 靶標從 10 個靶標中連續稀釋 10 倍5拷貝數/μL 低至 1 拷貝/μL 作為 MyTRACK 檢測的模板。通過檢測基因組 DNA 濃度最低的試管中的熒光信號來確定 LOD。對各種靶向分枝桿菌的檢測限為 1 - 100 拷貝/反應。


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