產(chǎn)品簡介：
 DAF-FM DA即3-Amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein, diacetate，也稱DAF-FM diacetate或4-Amino,5-aminomethyl-2’,7’-difluorescein, diacetate。DAF-FM DA是最新一代用于一氧化氮定量檢測(cè)的熒光探針，比以前比較常用的一氧化氮熒光檢測(cè)探針DAF-2 diacetate有多方面的改進(jìn)。首先，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，最后和一氧化氮反應(yīng)形成的熒光產(chǎn)物受pH值的影響小，在pH值大于5.5時(shí)不受pH值的影響。其次，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，前者產(chǎn)生的熒光更加穩(wěn)定，不容易淬滅，這樣更加便于檢測(cè)。另外，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，前者對(duì)一氧化氮的檢測(cè)靈敏度更高，相同條件下檢測(cè)靈敏度可以提高接近2倍，最低檢測(cè)濃度可以達(dá)到3nM。







 DAF-FM DA可以穿過細(xì)胞膜(cell-permeable)，進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶催化形成不能穿過細(xì)胞膜的DAF-FM 。DAF-FM本身僅有很弱的熒光，但在和一氧化氮反應(yīng)后可以產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，激發(fā)波長為495nm，發(fā)射波長為515nm。DAF-FM DA檢測(cè)一氧化氮的機(jī)制可以參考上圖。任何可以檢測(cè)fluorescein的儀器，包括熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀都可以用于該熒光探針的檢測(cè)。右圖為DAF-FM在不同濃度一氧化氮存在時(shí)的發(fā)射熒光掃描圖譜(fluorescence emission spectra)。
 DAF-FM DA的分子量為496.4，分子式為C25H18F2N2O7，HPLC分析純度大于98%。
 本DAF-FM DA為溶解于DMSO的淡黃色溶液，濃度為5mM。
 本熒光探針適合于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮水平，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。如果收集細(xì)胞后再裝載探針，通常至少可以檢測(cè)100個(gè)樣品。
包裝清單：
產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品名稱 包裝
S0019-1 DAF-FM DA (NO熒光探針) 5mM 20微升
S0019-2 DAF-FM DA稀釋液 50ml
— 說明書 1 份
保存條件：
-20℃保存，DAF-FM DA需避光保存，一年有效。
注意事項(xiàng)：
 BSA和酚紅(phenol red)對(duì)本熒光探針的檢測(cè)有干擾，需避免。
 第一次使用時(shí)請(qǐng)分裝成小包裝后-20℃保存，以避免反復(fù)凍融。
 熒光探針應(yīng)隨用隨配。配制好的探針工作液應(yīng)立即使用，不能以后再用。
 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 裝載探針
對(duì)于刺激時(shí)間較短(通常為2小時(shí)以內(nèi))的細(xì)胞，先裝載探針，后用適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照及自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(通常為6小時(shí)以上)的細(xì)胞，先用適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照及自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1:1000比例，用本試劑盒提供的DAF-FM DA稀釋液稀釋DAF-FM DA，使終濃度為5微摩爾/升。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DAF-FM DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的DAF-FM DA的體積為1毫升。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用PBS(pH7.4)洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA。
收集細(xì)胞后裝載探針：按照1:1000比例，用本試劑盒提供的DAF-FM DA稀釋液稀釋DAF-FM DA，使終濃度為5微摩爾/升。細(xì)胞收集后，用稀釋好的DAF-FM DA重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/毫升，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。上述操作可以在離心管內(nèi)進(jìn)行。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用PBS(pH7.4)洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA。直接用適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后再刺激細(xì)胞。
2. 檢測(cè)
對(duì)于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察(用普通的熒光顯微鏡觀察效果相對(duì)較差)，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。
3. 參數(shù)設(shè)置
使用495nm激發(fā)波長，515nm發(fā)射波長，實(shí)時(shí)、逐時(shí)間點(diǎn)或單時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DAF-FM和一氧化氮反應(yīng)產(chǎn)物的熒光光譜和fluorescein非常相似，可以用檢測(cè)fluorescein的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行檢測(cè)，用檢測(cè)FITC的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行檢測(cè)也可以。
4. 其它說明
上述推薦的DAF-FM DA的工作濃度為5微摩爾/升，對(duì)于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1:2000-1:5000的比例稀釋DAF-FM DA，使裝載探針時(shí)DAF-FM DA的濃度為1-2.5微摩爾/升。相反，如果發(fā)現(xiàn)用感興趣的藥物刺激后熒光較弱，可以把DAF-FM DA的工作濃度為調(diào)整為10微摩爾/升，以提高檢測(cè)的靈敏度。另外，探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。

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