引物合成

【服務介紹】
引物合成采用固相亞磷酰胺三酯法。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。

【服務特色】

• 實驗基地：全國多個城市都有實驗基地，近距離的提供服務。
• 快速交付：常規引物當日下單，次日送達（僅滿足有實驗基地的城市）。
• 質量可靠：嚴格的質控，所有修飾引物全部采用HPLC純化。
• 純化方式可選：可提供OPC(脫鹽)、PAGE、HPLC純化，滿足各種實驗需求。
• 引物標記：提供各種化學修飾堿基、生物素、熒光標記等（詳見修飾引物）。

（一）普通引物合成
普通引物類別：

常規引物：6-59 mer

長鏈引物：60-150 mer

純化方式選擇：

純化方式	5～20 mer	21～40 mer	41～60 mer	61～90 mer	91～150 mer	應用
OPC純化	適用	推薦	推薦	適用	不適用	PCR擴增、亞克隆、點突變、全基因合成及DNA測序等。
PAGE純化	不適用	適用	適用	推薦	推薦	對40 mer以上的普通引物的純化，用于定點突變、克隆、蛋白結合凝膠遷移電泳分析等。
HPLC純化	推薦	推薦	適用	不適用	不適用	小于50 mer的普通引物的純化，上述應用及修飾引物的純化；商業化的診斷引物或探針等。

收費方式：

引物長度	純化方式	合成量	收費方式
6-15 mer	OPC(脫鹽)	1-5 OD	20元/條
	PAGE	1-5 OD	20元/條
	HPLC	1-5 OD	20元/條 + 80元純化費
16-59 mer	OPC(脫鹽)	1-5 OD	1.2元/mer
	PAGE	1-5 OD	1.5元/mer
	HPLC	1-5 OD	1.2元/mer + 80元純化費
60-90 mer	OPC(脫鹽)	1-2 OD	4元/mer
	PAGE	1-2 OD	4元/mer
	HPLC	1-2 OD	4元/mer + 80元純化費
90-150 mer	OPC(脫鹽)	1-2 OD	7元/mer
	PAGE	1-2 OD	7元/mer
	HPLC	1-2 OD	7元/mer+80元純化費

【服務說明】

• 未注明合成量，我們將按照總量2 OD，分裝2管合成。
•  兼并堿基按照常規引物收費。
• 引物＜15 mer的按條收費，引物＞59 mer的按長鏈收費。
• 修飾引物價格計算方式：總價=常規引物的價格+修飾價格。
• 如需周末送貨，請與當地銷售聯系。
• 兼并引物對應：R=G+A 、Y=C+T 、K=G+T 、W=A+T 、S=C+G 、M=A+C 、B=C+G+T 、D=A+G+T 、H=A+C+T 、 V=A+C+G 、N=A+C+G+T

（二）修飾引物合成
修飾引物類別：

我們可以合成所有常見的修飾引物。我們合成的修飾引物全部采用HPLC純化，確保引物序列準確性和更好的純度。修飾引物的HPLC純化不收取純化費用。

修飾引物的價格=普通DNA 合成價格+修飾價格。

 雙標記引物合成： 
【引物常見問題】
Q-1、合成DNA溶液在室溫下放置了數天，還可以使用嗎?

A-1.溶液中的Oligo DNA常溫下數天（3-4天）應該沒問題，但最好不要放置一個星期以上。其壽命受溶液中的菌體、核酸酶等的影響。

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Q-2、怎樣理解測定的OD值?

A-2.進行OD值測定時，分光光度計上顯示的數值為每毫升溶液中的OD值。當測定200 ml溶液中的OD值為1.5時，溶液整體的OD量應該為多少？此時的OD值 = 1.5 OD/ml × 0.2 ml = 0.3 OD。

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Q-3、怎樣對合成的DNA制品進行定量?

A-3. DNA的量與260 nm處的吸光度值（OD值）成正比，因此使用紫外分光光度計定量是最科學的。1個OD值的合成DNA的重量約為33 mg。

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Q-4、合成Oligo DNA應怎樣保存?

A-4.保存合成的Oligo應該注意以下幾點： 

(1).干燥制品很穩定，常溫下數個月無問題。但為保證萬無一失，放置于-20℃保存為好。 

(2).溶解后的溶液DNA短期內（1-2周）使用可放置在4℃下保存，長期保存請放置于-20℃。溶解DNA時，請注意使用無菌、無核酸酶的水或TE Buffer。

(3).熒光標記引物請避光保存。

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Q-5、制品溶解后發現有少許沉淀，會影響實驗結果嗎?

A-5.所有的制品純化后都要進行脫鹽，脫鹽是使用C18柱進行的，偶而會有微量的樹脂溢出而進入制品。樹脂不影響任何反應結果，請稍許離心后取上清使用。

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Q-6、為什么PAGE級和高純度級制品的提供量比其他公司少?  

A-6.無論是PAGE純化，還是HPLC純化，增大每次的純化量會大大降低制品的純度。所以，為了保證制品質量，我們一般把每次的純化量控制在2 OD左右。大OD量的提供對提高純度是不現實，不科學的做法。一般，1 OD的20mer的DNA制品 (約5 nmol)，可以進行200-400 次的PCR反應 (50ml體系)，以及1,400次的測序反應。因此，2 OD 的DNA量可以足夠進行一般的實驗工作。

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Q-7、我公司的DNA制品包裝中為什么不提供電泳照片? 

A-7.進行過Oligo DNA PAGE電泳的人員都知道，同一OD量的不同序列的DNA制品電泳時的泳帶亮度（清晰度）是不一樣的。原因在于EB等染色劑的染色是滲透至DNA的雙鏈之間的，而合成的Oligo DNA是單鏈，Oligo DNA自身形成的立體結構越復雜，EB的染色就越容易，DNA帶也就越亮。相反，有一些Oligo DNA由于不形成立體結構，根本就不為EB所染色。因此，我們認為有些公司對所有產品都提供差不多同一亮度的制品的電泳照片是非常不現實的做法。

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Q-8、使用3%的Agarose凝膠電泳合成Oligo DNA制品，發現有很多條泳帶，為什么?

A-8.Oligo DNA的電泳一定要使用變性PAGE電泳。Oligo DNA是單鏈DNA，容易形成復雜的立體結構，因此進行Agarose電泳時，容易出現多條泳帶（更無法用Agarose電泳進行定量了)。

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Q-9、進行PAGE電泳時，長度完全一樣的Oligo DNA為什么泳帶不在同一位置?

A-8.Oligo DNA的電泳一定要使用變性PAGE電泳。Oligo DNA是單鏈DNA，容易形成復雜的立體結構，因此進行Agarose電泳時，容易出現多條泳帶（更無法用Agarose電泳進行定量了)。

(1). A、G、C、T的組份不同，電泳速度不同；

(2). DNA的立體結構不同，電泳速度不同。這種情況在Oligo DNA越短時越容易發生，長鏈Oligo DNA之間差別較小。

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Q-10、PCR產物經克隆后測序發現，引物處的堿基有錯誤，為什么?

(1). 合成機管路的瞬時阻堵，造成化學反應的瞬間中斷，其結果可能會發生單個(或一部分)堿基的缺失。

(2). 計算機程序失靈，控制錯誤合成。

(3). 合成過程中，堿基附加至DNA片段之前，堿基和堿基之間發生了偶聯，然后再附加到了DNA片段上，造成多堿基現象。

(4). 合成時堿基G可能會轉化成烯醇異構體，此時進行PCR反應時G會轉變成A。

(5). 合成過程中的脫嘌呤作用，對脫嘌呤后的堿基DNA聚合酶不能識別，此時可能觀察到A或G的缺失。嘌呤含量越高，就越容易發生這種情況。

(6). 不完全的脫保護結果。通常C脫得快，G脫得慢。不完全脫保護會發生堿基缺失。

(7). 合成過程中的Capping（蓋帽）反應不完全，使短片段DNA繼續參與合成，造成堿基缺失。 應該說，上述這些情況發生的可能性都極低。然而，合成的DNA鏈越長，發生這種情況的機率也就越大。

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Q-11、PCR產物經克隆后測序發現，引物處的堿基有錯誤，怎么辦?

A-11.(1). 因為引物純度不可能是100%，因此，挑選克隆時，有可能挑選了雜質引物擴增出的PCR產物的克隆。此時，請重新挑選一個克隆測序，也許結果會變好。

(2). 如果挑選2 ~ 3個克隆測序情況還沒改觀，我們會免費重新合成引物。

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Q-12、進行蛋白表達實驗數個月不成功，后經測序發現引物處有錯誤，怎么辦? 

A-12.(1). 表達實驗之前一定要對DNA序列進行驗證，這是實驗的常識。

(2). 我們可以免費重新合成引物。

(3). 如進行索賠時，按國際行業慣例，索賠范圍限于制品價格范圍之內。

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Q-13、怎樣才能保證Oligo DNA的正確性? 

A-13.(1). 合成Oligo DNA時，選用高純度級制品。

(2). 避免使用大于50mer的長鏈Oligo DNA，最好選用小于35mer的合成DNA制品。

(3). 進行克隆實驗時，每次克隆都須進行測序驗證，以保證序列的正確性，然后再進行進一步實驗。進行蛋白表達實驗時，尤其需要注意。

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Q-14、Oligo DNA最長可以合成多少個堿基? 

A-14.以每步反應效率為99%進行計算，粗略計算合成到100個堿基時，目的DNA片段的比例便為0 (精確數為37.0%)，要想保證合成DNA的堿基100%正確，Oligo DNA的長度最好不要超過70mer，80mer以上要想保證一個堿基不錯就非常危險了，須十分注意。

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Q-15、一般的合成Oligo DNA的5'和3'末端有Q嗎? (Q為修飾) 

A-15.沒有，5'和3'末端均為-OH基。如需要加Q，訂貨時請特別注明，此時需收取加Q (Q修飾) 的費用。

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Q-16、合成的引物進行PCR反應時無目的帶，怎么辦?

A-16.PCR反應失敗的原因很多，可以從以下幾個方面考慮。

(1). 引物和模板是否配對，同源性有多大?

(2). 引物本身是否有立體結構，或者二條引物之間是否形成高次結構?

(3). PCR反應用試劑是否能正常工作?

(4). PCR儀是否工作正常?

(5). PCR反應條件是否合適?

【公司簡介】
北京擎科生物科技有限公司（Tsingke Biotechnology Co., Ltd.）是一家為生命科學領域提供技術服務及產品的國家高新技術企業。公司深耕于基因合成技術及其上下游產品的開發應用，業務范圍涵蓋生命科學服務及產品、工具酶及合成生物學產品、生物制造CRO/CDMO開發與生產服務三大方向。公司肩負推動生物科技發展、讓世界更美好的使命，秉承品質、創新、共贏、奮斗的價值觀，始終將行業需求作為公司的導向，為客戶提供基因測序、DNA/RNA合成、分子生物學試劑、合成儀等儀器設備、化學合成原材料以及多種科研項目服務。

作為基因合成領域的佼佼者，經過多年的數據和經驗積累，專注于合成生物學研發及應用平臺搭建，形成了完整的基因合成產業鏈和完善的服務體系，業務覆蓋全國并延伸至美國、德國等多個海外國家和地區，累計為全球約12萬用戶提供服務與產品。

作為國家高新技術企業、北京市知識產權試點單位，擎科生物注重自主研發的同時，通過多領域專業人才的引進，不斷發展和完善核心技術創新研發體系。參與多項國家及省部級科技研發項目，同時參與制定了國家及行業相關標準。自公司成立以來，先后與天津大學、浙江工業大學、天津工業生物技術研究所等多家高校和科研院所進行戰略合作，并與知名院士團隊共建生物技術聯合創新中心，進行校企合作、培育行業人才，實現產學研一體化，引領合成生物學的創新發展。

擎科生物致力于為從事生命科學研究的科研人員及企事業單位提供高質量、本地化的生物技術服務和產品，公司已通過CNAS質量體系認證，擁有符合生物醫藥診斷標準的10萬級潔凈生產車間和自動化生產設備，以及超過12000m2的創新研發中心。截至2020年11月，擎科生物擁有91項專利及核心技術，其中40多項發明專利，使用擎科生物服務和產品客戶發表文章累計超過3100篇，影響因子累計超過1萬。

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