慢病毒(Lentivirus)載體是以 HIV-1 (人類免疫缺陷1型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。具有感染譜廣泛、可以有效感染分裂期和靜止期細(xì)胞、長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn),因此成為導(dǎo)入外源基因的有力工具。現(xiàn)在慢病毒系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種細(xì)胞系的基因過表達(dá)、RNA干擾、microRNA研究以及活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。

整體實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)流程(1、2、3為并列步驟)

1. 慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)上下游特異性擴(kuò)增引物,同時(shí)引入酶切位點(diǎn),采用PCR技術(shù)(采用高保真KOD酶,3K內(nèi)突變率為0%)從模板中(cDNA質(zhì)粒或者文庫)調(diào)取目的基因CDS區(qū)(coding sequence)連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下,裝入慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體。

2. 慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建 合成siRNA對(duì)應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu),退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體。

3. miRNA載體構(gòu)建從 Genomic 中調(diào)取基因相應(yīng)的Mir 前體, 并在調(diào)取引物中引入酶切位點(diǎn)。

4. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化 制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒(兩質(zhì)粒包裝系統(tǒng)),三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后6 h 更換為完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)48和72h后,分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液,病毒上清液通過超離心濃縮病毒。