表達(dá)純化后的蛋白產(chǎn)物，特別是蛋白品的分析過程中，需要對蛋白的末端進(jìn)行驗證，以保證表達(dá)純化產(chǎn)物的N端和C端序列準(zhǔn)確。Edman降解法是蛋白的N端序列分析中非常成熟的方法之一，有著廣泛的應(yīng)用。百泰派克公司采用島津公司Edman測序系統(tǒng)，為廣大科研工作者和科研客戶提供純化后蛋白產(chǎn)物、抗體以及蛋白疫苗的N端測序服務(wù)。采用我們的測序系統(tǒng)，可以測定N端30個氨基酸的序列信息。采用特定的蛋白上樣系統(tǒng)，可以測定N端的60-70個氨基酸。百泰派克公司也建立了以先進(jìn)的LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行N-端測序的平臺，可以測出封閉和修飾的蛋白質(zhì)末端，與Edman降解法形成互補(bǔ)，保證N端測序服務(wù)的順利進(jìn)行。

在蛋白質(zhì)測序前，蛋白樣品首先經(jīng)過SDS-PAGE的分離，保證樣品的純度滿足測序的要求；隨后將SDS-PAGE上的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；經(jīng)過染色確定把蛋白條帶并切出；使用Edman測序儀對得到的PVDF膜上的蛋白樣品進(jìn)行分析。Edman降解測序是通過循環(huán)反應(yīng)從蛋白質(zhì)的N端開始逐個鑒定氨基酸的種類，從而對蛋白質(zhì)的N端序列進(jìn)行測定。每一個Edman測序反應(yīng)包括3步：第一步是在堿性條件下，PITC與蛋白N端的游離氨基結(jié)合；第二步是在酸性溶液中，N端殘基被切除；第三步是PITC結(jié)合的殘基轉(zhuǎn)化成為更為穩(wěn)定的PTH殘基，經(jīng)過在線的HPLC分析，根據(jù)洗脫時間確定氨基酸種類。

Edman測序反應(yīng)過程

Edman測序?qū)嶒灹鞒虉D

• 蛋白表達(dá)產(chǎn)物的驗證：重組蛋白插入位點和表達(dá)順序是否正確；
• 細(xì)胞株建立和發(fā)酵過程中蛋白產(chǎn)物的驗證：驗證細(xì)胞株建立和發(fā)酵過程中蛋白產(chǎn)物N端甲硫氨酸和信號肽是否正確處理；
• 蛋白降解/酶切分析：對降解/酶切形成的新蛋白片段N端進(jìn)行分析，確定斷裂/酶切位點；
• De-novo測序：對于蛋白數(shù)據(jù)庫中不存在的全新蛋白序列進(jìn)行分析。

PVDF膜類樣品的準(zhǔn)備過程

1.樣品電泳和電轉(zhuǎn)
a. 對蛋白樣品進(jìn)行1D或者2D跑膠
b. 將蛋白膠上的樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；注意：千萬不要使用硝酸纖維素膜（Nitrocellulose membranes）
c. 在此過程中請佩戴手套和頭套，避免自身角蛋白對測序結(jié)果的影響

2.PVDF膜的染色
a. 染色過程中可以使用考馬斯亮藍(lán)或者立春紅對PVDF膜進(jìn)行染色；注意：千萬不要使用銀染的方法進(jìn)行染色
b. 染色完成之后，可以使用雙蒸水對PVDF膜進(jìn)行清洗
c. 如果轉(zhuǎn)膜的緩沖液中含有甘氨酸，需要對PVDF膜進(jìn)行多次沖洗，以避免甘氨酸對后續(xù)分析的影響
d. 更詳細(xì)的樣品準(zhǔn)備步驟，見Edman測序樣品準(zhǔn)備Protocol

3.靶蛋白條帶獲取
a. PVDF膜染色后，靶條帶清晰可見，用潔凈的解剖刀將靶蛋白條帶切下
b. 在蛋白量允許的情況下，可以準(zhǔn)備2-3條靶條帶以增加靶蛋白的量

4.樣品運(yùn)輸
對切下的蛋白條帶進(jìn)行密閉包裝，使用冰袋運(yùn)輸即可

溶液樣品的準(zhǔn)備過程

1.蛋白的純度和用量
a. 樣品需要量在1-10 ug
b. 樣品純度要＞90%
c. Buffer中不要使用表面活性劑，并盡可能降低溶液的鹽濃度
d. Tris, glycine, guanidine, glycerol, sucrose, ethanolamine, SDS, Triton, X-100, Tween和其他的去垢劑，ammonium sulfate和其他的銨鹽均會對后續(xù)的氨基酸鑒定產(chǎn)生影響，在樣品準(zhǔn)備過程中要避免使用
e. 樣品準(zhǔn)備過程全程佩戴口罩和頭套，避免角蛋白的影響

2.蛋白樣品的運(yùn)輸
a. 液體樣品推薦干冰運(yùn)輸
b. 液體樣品也可以在冷凍抽干或者真空抽干后，使用冰袋運(yùn)輸

如下圖所示，通過Edman測序，可提供鑒定的氨基酸的詳細(xì)信息。

Edman測序研究案例

在技術(shù)報告中，百泰派克會為您提供詳細(xì)的中英文雙語版技術(shù)報告，報告包括：
1. 實驗步驟（中英文）
2. 相關(guān)的質(zhì)譜參數(shù)（中英文）
3. 蛋白質(zhì)N端測序的詳細(xì)信息
4. 質(zhì)譜圖片
5. 原始數(shù)據(jù)