CRISPR-Cas 系統自問世以來，從作為基因編輯的利器開始，發展至今已成為核酸檢測的新型工具。特別是近年來，新型冠狀病毒的快速檢測需求增大。國內多位專家已發表過多篇應用 CRISPR-Cas 技術快速、靈敏地檢測新冠病毒的文章。但目前基于 CRISPR 技術的檢測仍以定性檢測為主，定量檢測仍有方法學上的難度。因此，在保證能定量研究的前提下確保檢測方法的靈敏度、特異性和時效性是如今研究的下一個重點。

達普生物的聯合創始人姚舒懷教授團隊利用液滴微流控技術，在 CRISPR診斷領域合作取得新的進展。姚教授團隊將 RPA 擴增與 Cas13a 檢測融合為一步法 MEDICA（Microfluidics-Enabled Digital Isothermal Cas13a Assay），此方法不僅減少了 CRISPR 技術的檢測時間，而且保證了檢測方法的靈敏度、特異性，更是實現了對檢測目標的絕對定量。該成果發表于分析化學領域的頂級期刊 Analytical Chemistry，影響因子 8.008。

香港科技大學姚舒懷團隊發現，大多數 CRISPR 檢測診斷平臺通過檢測熒光或條帶，得到一個可視化、定性的結果。當需要相對定量的時候，需要 RPA 擴增及 Cas13a 檢測兩個步驟，并且使用熒光定量 PCR 通過一定的擴增循環與熒光檢測來實現。這給工作流程帶來更多的不確定性，且定量還會受到標準曲線的限制與影響。在本文中，姚教授將 RPA 反應與 Cas13a 檢測通過微流控技術結合到一步法中（MEDICA），不僅提升了檢測靈敏度，而且實現了穩定的絕對定量。
 

使用達普液滴微流控技術，將水相 1（檢測模板、預混液）與水相 2（MgOAc）在需要反應時進行混合，混合后的水相與油相在微流控芯片中生成微液滴，再進行恒溫反應。初始模板在分配進微液滴時符合泊松分布，因此可以根據泊松分布模型進行絕對定量的計算工作。
 

本文在試驗優化及驗證階段，姚教授團隊通過不同濃度及 pH 的 Tris-HCL、不同濃度的鹽條件（NH₄(SO₄)₂, NaCl, KCl, CH₃COOK）及不同濃度的 PEG、Tween-20、引物探針等進行摸索試驗，最終選定了一個最佳的優化條件。

在確定了反應最佳條件后，姚教授團隊使用 HPV 16 質粒構建并且驗證了一步法 RPA + Cas13a 于微流控體系中（數字恒溫 CRISPR 方法）。上圖可見，構建的數字恒溫 CRISPR 方法靈敏度達到 1~5 copies/μL，穩定性也表現出色。

為了檢驗方法學在實際臨床應用中的性能，姚教授團隊使用質粒進行線性關系驗證與臨床樣本進行驗證，結果均展現較好的一致性。

姚教授團隊構建的數字恒溫 CRISPR 方法與臨床使用 qPCR 方法檢測 HPV16/HPV18 結果對比，陰陽性符合率達到 100%，并且將 CT 值與數字恒溫 CRISPR 方法得到的絕對定量結果做相關性分析，R²＞0.95/0.93（HPV16/HPV18）。方法學產生差異的原因可能是 qPCR 標準品是由質粒代替，在低濃度下（CT 值 36 左右）與臨床樣本具有一定的差異性。另外，qPCR 會因為基因的偏好性，而展現出不同的擴增效率。由此可見，數字恒溫 CRISPR 方法無需依賴標準品即可進行絕對定量，并且可以帶來更快的檢測速度和更靈敏的檢測下限。

達普生物秉承為廣大科研及臨床工作者和企業客戶提供世界領先技術平臺的理念，聚團隊研發力量結晶開發了基于微流控技術的全流程解決方案。