文章分享ChIP-seq：如何解開擬南芥復(fù)制應(yīng)激謎團(tuán)？
2023年7月，在《Molecular Plant》期刊上發(fā)表的一篇研究論文“Distinctive and complementary roles of E2F transcription factors during plant replication stress responses”，該研究以擬南芥為對象，探究E2FA和E2FB轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)中的作用。
DNA精確復(fù)制對生物遺傳穩(wěn)定性至關(guān)重要，但多種因素會引發(fā)復(fù)制應(yīng)激，威脅基因組完整性。植物受脅迫時觸發(fā)的DDR可能與復(fù)制應(yīng)激增加有關(guān)，其DDR依賴ATM和ATR激活，SOG1參與調(diào)控，但部分轉(zhuǎn)錄反應(yīng)受未知因子影響。擬南芥的E2F家族成員各有“分工”，E2FA和E2FB部分功能還存在重疊，它們在這場關(guān)乎植物生死的戰(zhàn)斗中，究竟是如何發(fā)揮作用的？
研究人員運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法，借助ChIP-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)了它們與SOG1之間千絲萬縷的聯(lián)系——大量共同靶基因和相近的結(jié)合位點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)就像一把鑰匙，似乎要打開植物應(yīng)對復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制的神秘大門。這扇大門背后究竟隱藏著哪些驚人的秘密？讓我們一同深入文章，探尋其中的奧秘吧！
技術(shù)路線
DNA精確復(fù)制對生物遺傳穩(wěn)定性至關(guān)重要，但多種因素會引發(fā)復(fù)制應(yīng)激，威脅基因組完整性。植物受脅迫時觸發(fā)的DDR可能與復(fù)制應(yīng)激增加有關(guān)，其DDR依賴ATM和ATR激活，SOG1參與調(diào)控，但部分轉(zhuǎn)錄反應(yīng)受未知因子影響。擬南芥的E2F家族成員各有“分工”，E2FA和E2FB部分功能還存在重疊，它們在這場關(guān)乎植物生死的戰(zhàn)斗中，究竟是如何發(fā)揮作用的？
研究人員運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法，借助ChIP-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)了它們與SOG1之間千絲萬縷的聯(lián)系——大量共同靶基因和相近的結(jié)合位點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)就像一把鑰匙，似乎要打開植物應(yīng)對復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制的神秘大門。這扇大門背后究竟隱藏著哪些驚人的秘密？讓我們一同深入文章，探尋其中的奧秘吧！
技術(shù)路線
研究結(jié)果
1.E2FA、E2FB與SOG1共享一些靶基因
本研究選用擬南芥作為研究對象，通過ChIP-seq技術(shù)分析，對比E2FA、E2FB與SOG1的靶基因并確定它們在靶基因上的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者存在大量共同靶基因，如WEE1基因，它們在靶基因上的結(jié)合位點(diǎn)相近。GUS染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E2FA/B可獨(dú)立于SOG1激活WEE1，表明E2FA/B可能參與復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)。
1.E2FA、E2FB與SOG1共享一些靶基因
本研究選用擬南芥作為研究對象，通過ChIP-seq技術(shù)分析，對比E2FA、E2FB與SOG1的靶基因并確定它們在靶基因上的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者存在大量共同靶基因，如WEE1基因，它們在靶基因上的結(jié)合位點(diǎn)相近。GUS染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E2FA/B可獨(dú)立于SOG1激活WEE1，表明E2FA/B可能參與復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)。
圖1. E2FA、E2FB和SOG1共享共同的目標(biāo)基因，并獨(dú)立激活WEE1。
2.E2FB的缺失會嚴(yán)重加劇復(fù)制壓力引起的生長缺陷
為了探討E2FA和E2FB在復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)中的作用，以pol2a-4突變體為基礎(chǔ)，構(gòu)建與sog1、e2fa或e2fb的雙突變和三突變體，觀察各突變體的生長表型，結(jié)果顯示，e2fb-1 pol2a雙突變體和e2fb-1 pol2a sog1三突變體的生長缺陷比pol2a和pol2a sog1更嚴(yán)重，而e2fa-1突變對生長影響不明顯。分析各種突變體的根長數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)E2FB而非E2FA對于在持續(xù)復(fù)制壓力下生長的植物根部生長是必需的。這些結(jié)果表明，E2FB有助于植物對復(fù)制壓力的響應(yīng)，即使存在復(fù)制缺陷也能維持生長。
為了探討E2FA和E2FB在復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)中的作用，以pol2a-4突變體為基礎(chǔ)，構(gòu)建與sog1、e2fa或e2fb的雙突變和三突變體，觀察各突變體的生長表型，結(jié)果顯示，e2fb-1 pol2a雙突變體和e2fb-1 pol2a sog1三突變體的生長缺陷比pol2a和pol2a sog1更嚴(yán)重，而e2fa-1突變對生長影響不明顯。分析各種突變體的根長數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)E2FB而非E2FA對于在持續(xù)復(fù)制壓力下生長的植物根部生長是必需的。這些結(jié)果表明，E2FB有助于植物對復(fù)制壓力的響應(yīng)，即使存在復(fù)制缺陷也能維持生長。
圖2. E2FB，而不是E2FA，是植物在復(fù)制壓力下持續(xù)生長所必需的。
3.E2FB在應(yīng)對復(fù)制壓力時正向調(diào)節(jié)分生組織大小和細(xì)胞周期進(jìn)展
通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)復(fù)制應(yīng)激會導(dǎo)致根分生組織大小減小。細(xì)胞周期分析顯示，E2FB缺失會延遲S期和G2-M期的進(jìn)程，表明E2FB正調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，尤其是在G2期和G2/M轉(zhuǎn)換期。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測花buds也得到了相同的結(jié)果。以上結(jié)果表明，E2FB通過復(fù)制壓力暴露的細(xì)胞中G2期的進(jìn)展和G2/M期的開始來正向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)展。
通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)復(fù)制應(yīng)激會導(dǎo)致根分生組織大小減小。細(xì)胞周期分析顯示，E2FB缺失會延遲S期和G2-M期的進(jìn)程，表明E2FB正調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，尤其是在G2期和G2/M轉(zhuǎn)換期。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測花buds也得到了相同的結(jié)果。以上結(jié)果表明，E2FB通過復(fù)制壓力暴露的細(xì)胞中G2期的進(jìn)展和G2/M期的開始來正向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)展。
圖3. E2FB缺失，而不是E2FA缺失，通過延遲細(xì)胞周期的進(jìn)展，進(jìn)一步減少了pol2a背景下的根頂端分生組織長度。
4.復(fù)制應(yīng)激誘導(dǎo)基因受E2Fs和SOG1雙重控制
通過對pol2a、pol2a sog1和e2fb-1 pol2a sog1突變體的莖尖進(jìn)行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)1095個基因在三種突變體中均上調(diào)，這些基因與DNA修復(fù)、復(fù)制和細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控相關(guān)。SOG1靶基因可分為三組，分別主要受SOG1調(diào)控、受SOG1和E2FB拮抗調(diào)控、受E2FA和E2FB冗余激活且部分依賴SOG1，表明E2Fs和SOG1對DDR基因存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。
通過對pol2a、pol2a sog1和e2fb-1 pol2a sog1突變體的莖尖進(jìn)行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)1095個基因在三種突變體中均上調(diào)，這些基因與DNA修復(fù)、復(fù)制和細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控相關(guān)。SOG1靶基因可分為三組，分別主要受SOG1調(diào)控、受SOG1和E2FB拮抗調(diào)控、受E2FA和E2FB冗余激活且部分依賴SOG1，表明E2Fs和SOG1對DDR基因存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。
圖4. E2FB和SOG1協(xié)同控制復(fù)制應(yīng)激誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化。
5.E2FA、E2FB和SOG1協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程
首先構(gòu)建e2fa-2 e2fb-1 sog1三突變體，用HU誘導(dǎo)復(fù)制應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)sog1突變體對復(fù)制應(yīng)激略有敏感性，而e2fa、e2fb單突變體以及e2fa-2 e2fb-1雙突變體則無明顯的這種超敏感性。e2fb-1 sog1雙突變體比sog1突變體對HU更敏感，這與E2FB在復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)中比E2FA發(fā)揮更重要作用的假設(shè)相符。值得注意的是，e2fa-2 e2fb-1 sog1三突變體對HU表現(xiàn)出更強(qiáng)的超敏感性，其根生長在轉(zhuǎn)移到HU后幾乎完全被阻斷，并且根分生組織中出現(xiàn)細(xì)胞死亡。
進(jìn)一步探究了E2F缺失的影響，研究人員發(fā)現(xiàn)，在野生型背景下，E2F缺失可能會引發(fā)復(fù)制應(yīng)激。e2fa-2 e2fb-1雙突變體表現(xiàn)出S期延長和總細(xì)胞周期長度增加的現(xiàn)象，且這些缺陷在sog1突變體背景下消失，這表明E2F缺失會觸發(fā)復(fù)制應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致SOG1依賴的細(xì)胞周期延遲。通過對7日齡幼苗根尖的RNA-seq分析，研究人員發(fā)現(xiàn)e2fa-2 e2fb-1雙突變體中有148個基因下調(diào)，其中73個可能是E2FA或E2FB的直接靶基因；同時有345個基因上調(diào)，其中145個是E2FA或E2FB結(jié)合的基因，且這些上調(diào)基因中43個是SOG1的靶基因，這進(jìn)一步證實(shí)了E2FA和E2FB缺失會觸發(fā)復(fù)制應(yīng)激，并導(dǎo)致SOG1依賴的DDR基因激活。
首先構(gòu)建e2fa-2 e2fb-1 sog1三突變體，用HU誘導(dǎo)復(fù)制應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)sog1突變體對復(fù)制應(yīng)激略有敏感性，而e2fa、e2fb單突變體以及e2fa-2 e2fb-1雙突變體則無明顯的這種超敏感性。e2fb-1 sog1雙突變體比sog1突變體對HU更敏感，這與E2FB在復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)中比E2FA發(fā)揮更重要作用的假設(shè)相符。值得注意的是，e2fa-2 e2fb-1 sog1三突變體對HU表現(xiàn)出更強(qiáng)的超敏感性，其根生長在轉(zhuǎn)移到HU后幾乎完全被阻斷，并且根分生組織中出現(xiàn)細(xì)胞死亡。
進(jìn)一步探究了E2F缺失的影響，研究人員發(fā)現(xiàn)，在野生型背景下，E2F缺失可能會引發(fā)復(fù)制應(yīng)激。e2fa-2 e2fb-1雙突變體表現(xiàn)出S期延長和總細(xì)胞周期長度增加的現(xiàn)象，且這些缺陷在sog1突變體背景下消失，這表明E2F缺失會觸發(fā)復(fù)制應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致SOG1依賴的細(xì)胞周期延遲。通過對7日齡幼苗根尖的RNA-seq分析，研究人員發(fā)現(xiàn)e2fa-2 e2fb-1雙突變體中有148個基因下調(diào)，其中73個可能是E2FA或E2FB的直接靶基因；同時有345個基因上調(diào)，其中145個是E2FA或E2FB結(jié)合的基因，且這些上調(diào)基因中43個是SOG1的靶基因，這進(jìn)一步證實(shí)了E2FA和E2FB缺失會觸發(fā)復(fù)制應(yīng)激，并導(dǎo)致SOG1依賴的DDR基因激活。
圖5. E2FA、E2FB和SOG1的同時缺失消除了植物對復(fù)制應(yīng)激的耐受性。
圖6. E2F缺失會引發(fā)復(fù)制壓力、SOG1依賴的細(xì)胞周期延遲和DDR基因的激活。
圖6. E2F缺失會引發(fā)復(fù)制壓力、SOG1依賴的細(xì)胞周期延遲和DDR基因的激活。
綜上所述，本研究揭示了一個復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)在植物應(yīng)對復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用，其中E2Fs和SOG1作為核心調(diào)節(jié)因子，共同維持植物基因組的穩(wěn)定性和細(xì)胞周期的正常運(yùn)行。
圖7. SOG1、E2FA和E2FB作用于不同的共同靶點(diǎn)，以微調(diào)植物DDR。
標(biāo)簽：
ChIP-seq
染色質(zhì)免疫共沉淀測序
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