雙光子探針在生物醫學成像領域的創新應用
在生物醫學研究的微觀世界里，成像技術無疑是科學家們洞察生命奧秘的“眼睛”。從早期的光學顯微鏡到如今的前沿成像手段，每一次技術的躍遷都為我們揭開了生命活動更精細、更深層的面紗。雙光子顯微鏡（TPM）作為新一代的成像利器，以其獨特的物理原理和卓越的性能，在生物醫學領域掀起了一場成像革命。雙光子顯微鏡采用近紅外光子作為激發源，利用兩個低能光子同時被吸收來激發熒光分子，這一過程具有空間局域性，能夠實現高分辨率的三維成像，同時減少光漂白和光毒性，為活體組織的長期觀察提供了可能。
研究背景與技術挑戰
光學成像技術的局限性
光學成像技術在生命科學研究中扮演著舉足輕重的角色。傳統的共聚焦顯微鏡雖能實現細胞水平的熒光成像，卻受限于紫外-可見光（UV-Vis）單光子激發方式。這種激發模式下，光子穿透組織深度有限，易受組織自身熒光干擾，且連續激光易造成光漂白和光毒性，損害生物樣本。這些局限性嚴重制約了科學家們對生物體內深處結構和動態過程的觀察。
雙光子顯微鏡應運而生，它采用近紅外光（NIR，700-1100nm）的兩個低能光子作為激發源。該技術優勢顯著：一是近紅外光子穿透力強，可深入組織內部，突破傳統成像深度極限，實現對活體組織深層次結構的成像；二是雙光子激發具有空間局域性，可實現三維成像，提升分辨率，減少背景干擾；三是飛秒脈沖激光總能量低，有效降低光漂白和光毒性，有利于對活細胞和組織的長期觀察。這些優勢使雙光子顯微鏡在神經科學、細胞生物學、發育生物學等多個領域展現出巨大潛力。
高效探針研發的瓶頸
然而，目前雙光子探針的研發仍面臨諸多挑戰。理想的探針需具備高選擇性、良好水溶性、細胞通透性、大雙光子作用截面、高光穩定性及低毒性等特性，以滿足多樣化的生物醫學需求。探針是雙光子顯微鏡成像的關鍵，它直接決定了成像的特異性和靈敏度。但兼具這些性能的探針研發難度極大，這在很大程度上限制了雙光子顯微鏡的廣泛應用。現有探針在生物靶點的選擇性、成像深度、信號強度等方面仍存在不足，難以滿足復雜生物環境下的高精度成像需求。
技術創新與應用
脂筏成像探針的突破
為攻克探針研發難題，科研團隊展開深入研究。在脂筏成像方面，針對傳統探針在細胞中表現不佳的問題，研究人員開發出C-laurdan（CL）。這一改進顯著提升了探針水溶性，使其在不同類型脂質環境中均能精準反映脂筏和非脂筏區域，克服了傳統探針的局限性。CL在細胞膜中展現出良好的平行排列，其熒光發射峰在不同脂質環境中的變化與脂筏的物理狀態高度相關，為脂筏的可視化提供了可靠工具。實驗結果表明，CL標記的細胞在經過處理破壞脂筏后，其GP曲線發生顯著變化，高GP值部分明顯下降，而低GP值部分保持穩定，這一結果與脂筏破壞引起的細胞膜物理性質改變高度一致，確證了CL對脂筏的精準標識能力。
進一步地，團隊又研發了CL2和SL2雙光子開啟探針。CL2在脂筏中特異性發射熒光，成像背景清晰。實驗顯示，CL2標記的巨噬細胞在MβCD處理后熒光信號消失，而補充膽固醇又可使其恢復，且與商業脂筏探針成像結果高度吻合。SL2則憑借磺酸基團的親水性，減少細胞內攝取，更適用于長期成像。SL2在293T細胞和新鮮大鼠海馬腦片成像中，展現出對細胞膜脂筏的清晰標記，且細胞內攝取極少，為活體組織脂筏研究提供了可靠手段。SL2標記的大鼠海馬腦片TPM圖像清晰地展現了CA1和CA3區域以及齒狀回的脂筏分布，即使在約100μm的深度，仍能分辨出細胞膜上的亮區，這些亮區在MβCD處理后消失，進一步驗證了SL2對脂筏的特異性。
細胞器成像探針的創新在細胞器成像領域，團隊開發出針對溶酶體和線粒體的雙光子探針。用于溶酶體的兩種探針（CLT-blue和CLT-yellow），以及分別針對線粒體和溶酶體的BLT-blue和FMT-green探針，均展現出優異的成像性能。這些探針發射波長不同，可實現雙色成像，同時具備高光穩定性、低細胞毒性和抗pH變化的特性。兩種探針的發射峰分別為470nm和550nm，雙光子作用截面分別為50GM和47GM，能夠在較低激光功率下產生明亮的熒光信號。實驗中，這兩種探針標記的HeLa細胞，其TPM圖像與溶酶體的光學成像結果高度重合，而與高爾基體和線粒體無重疊，證明了其對溶酶體的特異性標記能力。
兩種探針的雙光子作用截面分別為160GM和175GM，具有較高的亮度和穩定性。在RAW264.7細胞中，這兩種探針分別對線粒體和溶酶體進行標記，TPM圖像與光學成像結果一致，且在生物相關pH范圍內不敏感，可長期穩定成像。實驗結果顯示，在饑餓處理2小時后，溶酶體和線粒體的共定位系數顯著增加，這與自噬過程中線粒體被溶酶體降解的生物學機制高度吻合。
pH測量探針的開發此外，針對胃食管反流病（GERD）等與pH變化相關的疾病診斷難題，團隊研發出比率型雙光子pH探針NP1。NP1在不同pH值下藍綠熒光發射強度比值（Iblue/Igreen）發生顯著變化，可實現組織內部pH值的精準測量。實驗表明，NP1的Iblue/Igreen比值隨pH值的降低而增加，覆蓋pH2.45至6.50的廣泛范圍，且該比值與pH值呈良好的線性關系。動物實驗與人體組織測試表明，NP1能有效區分正常組織與病變組織的pH差異。在對胃食管組織的成像中，NP1可以從90-180μm深度獲取組織pH值，為GERD病理研究和非侵蝕性胃食管反流病（NERD）診斷提供了關鍵數據支持。
成像實驗與結果分析
脂筏成像實驗
SL2在293T細胞和新鮮大鼠海馬腦片成像中，展現出對細胞膜脂筏的清晰標記，且細胞內攝取極少。SL2標記的大鼠海馬腦片TPM圖像清晰地展現了CA1和CA3區域以及齒狀回的脂筏分布，即使在約100μm的深度，仍能分辨出細胞膜上的亮區，這些亮區在MβCD處理后消失，進一步驗證了SL2對脂筏的特異性。這些實驗結果表明，新型脂筏探針在細胞和組織水平上均能實現對脂筏的精準成像，為研究細胞膜的結構與功能提供了有力工具。
細胞器成像實驗
對于細胞器成像，兩種探針標記的HeLa細胞，其TPM圖像與溶酶體的光學成像結果高度重合，而與高爾基體和線粒體無重疊。兩種探針在RAW264.7細胞中成像效果與溶酶體和線粒體的光學成像結果一致。在自噬實驗中，經雷帕霉素誘導自噬后，TPM圖像顯示溶酶體熒光增強、線粒體熒光減弱，且二者融合程度隨時間增加。這一過程直觀展現了自噬過程中線粒體被溶酶體降解的動態過程。在組織成像中，這兩種探針在120μm深度處仍能清晰分辨溶酶體和線粒體分布，TPM圖像顯示二者在組織中的分布特征與預期一致，且在不同區域的分布差異也能被清晰捕捉，為研究細胞器在組織中的相互作用和功能提供了重要依據。
NP1探針在人體胃食管組織成像中表現出色，可從90-180μm深度獲取組織pH值。實驗測得胃部pH值約為2.1，正常與食管炎患者的胃部pH值接近，但在胃食管連接處和食管下括約肌上方5cm處，食管炎患者的pH值顯著低于對照組。這一結果與GERD的病理特征相符，即食管腔內酸性環境增強是GERD發病的關鍵因素。此外，NP1探針對不同深度組織的pH測量結果顯示，盡管組織紋理略有變化，但pH值測量結果穩定，表明該探針在組織內部具有良好的滲透性和穩定性，能夠提供準確的pH值信息。這些實驗數據為GERD的病理研究和NERD的診斷提供了重要依據，也為未來開發基于雙光子探針的臨床診斷技術奠定了基礎。
總結與展望
雙光子探針的技術革新，標志著生物醫學成像從“結構觀察”邁向“功能解析”的新階段。通過分子設計優化，CL、SL2等探針成功克服了傳統工具的靈敏度與特異性瓶頸，而雙色系統則為細胞器互作研究提供了動態窗口。NP1的臨床驗證更是證明，雙光子技術有望從實驗室走向病床，成為疾病早期診斷的有力工具。隨著探針庫的擴充與成像系統的微型化，雙光子技術或將在腫瘤免疫治療、神經環路解析及個性化醫療中發揮更核心的作用。
聲明：本文僅用作學術目的。
Lim CS, Cho BR. Two-photon probes for biomedical applications. BMB Rep. 2013 Apr;46(4):188-94.
DOI:10.5483/bmbrep.2013.46.4.045.
