Fluoro-Gold雙光子成像：實現小鼠腦干神經元超深度成像
在神經科學研究中，逆行神經元追蹤技術是解析復雜神經環路的關鍵工具。自19世紀高爾基染色技術開創神經解剖學研究以來，科學家們不斷探索更精準的標記方法。Fluoro-Gold（FG）作為目前最常用的熒光逆行示蹤劑，憑借其高亮度、抗光漂白性及細胞質特異性標記能力，成為神經環路研究的“金標準”。然而，傳統寬場熒光顯微技術受限于軸向分辨率不足，無法實現深層組織的三維成像；而共聚焦顯微鏡因紫外激發需求與穿透深度限制，難以滿足活體或厚組織樣本的高分辨需求。
雙光子激發顯微技術（2PEM）通過近紅外飛秒激光激發熒光分子，突破了光學穿透深度與空間分辨率的瓶頸，但其在FG成像中的應用長期未被系統研究。基于《Scientific Reports》最新研究成果，解析FG的雙光子激發光譜與熒光壽命特性，揭示其在深層神經成像中的突破性應用，為神經退行性疾病研究與神經再生醫學提供全新視角。
研究背景與技術挑戰
逆行示蹤劑的演進與FG的生物學特性
從早期的辣根過氧化物酶到現代熒光染料，逆行示蹤技術的發展始終圍繞提升標記特異性與成像效率。FG的活性成分羥基芪巴脒（OHSA）通過軸突末端攝取并逆行運輸至胞體，在溶酶體中富集形成穩定標記。其熒光特性受pH調控：中性環境發射黃色熒光，酸性條件下藍移。這種特性使其在活體與固定組織均能保持高信噪比，但傳統紫外激發方案限制了其與現代顯微平臺的兼容性。
寬場熒光顯微技術缺乏光學切片能力，共聚焦顯微鏡雖能實現三維重建，但受限于紫外激光器的稀缺性與組織穿透深度（通常<100 μm）。此外，FG的廣譜發射特性易與其他熒光標記物（如脂褐素自發熒光）發生串擾，導致多色成像困難。如何實現FG標記神經元的高分辨率深層成像，并解決光譜重疊問題，成為技術突破的關鍵。
技術創新與應用
雙光子激發光譜的首次表征
研究團隊通過可調諧鈦寶石激光器（720-990 nm）系統測量了FG的雙光子激發光譜。結果顯示，FG在720 nm處呈現最大激發效率，與其單光子紫外吸收峰（350 nm）呈近似倍頻關系。這一發現填補了FG光學特性的空白，為雙光子成像參數優化提供了直接依據。值得注意的是，在腦組織背景下，760 nm激發可最大化FG與自發熒光的信噪比，提示波長選擇需兼顧組織光學特性。
通過時間相關單光子計數技術，研究者測得FG的熒光壽命呈雙指數分布：快速衰減組分（<100 ps）與慢速組分（2.3 ns），平均壽命為1.4 ns。相較于脂褐素（1.3 ns），FG的壽命差異雖小，但通過FLIM仍可實現有效分離。這種基于壽命對比的策略，為多標記實驗中消除背景干擾提供了新思路，尤其適用于神經退行性疾病研究中病理蛋白共定位分析。
折射率匹配提升成像深度
針對厚組織光散射問題，研究采用甘油浸沒物鏡結合商用折射率匹配液，使全腦干樣本的成像深度突破450 μm。相較于水浸物鏡（150 μm極限），該方案通過減少球差與光衰減，實現了近乎單細胞分辨率的深層成像。這一技術路徑為全器官尺度神經環路重建奠定了基礎。
成像實驗與結果分析
高分辨率三維重建與亞細胞結構解析
在面神經運動核標記實驗中，雙光子成像清晰展現了神經元胞體、樹突及胞內囊泡結構。相較于寬場成像的模糊輪廓，2PEM可分辨直徑<1 μm的樹突棘，為突觸可塑性研究提供形態學量化基礎。通過機器學習驅動的三維分割算法，研究者實現了自動化的細胞計數與空間分布統計，效率較傳統切片法提升十倍以上。
研究進一步將FG與FR分別標記面神經不同分支，成功區分相鄰運動亞核的投射特異性。結合FLIM技術，雙光子平臺可同步解析多色標記信號，為神經環路拓撲圖譜繪制提供工具。此外，FG與免疫組化及組織透明化技術的兼容性（如CLARITY），預示其在跨尺度成像中的廣泛應用潛力。
總結與展望
FG的雙光子特性表征標志著神經成像技術的重要突破。通過優化激發波長（720 nm）與折射率匹配方案，研究者實現了哺乳動物全腦干尺度的高分辨三維成像，并結合FLIM技術解決了復雜生物樣本中的信號串擾問題。這些進展不僅提升了逆行示蹤實驗的效率和精度，更為神經再生、疼痛環路解析及退行性疾病機制研究開辟了新路徑。隨著雙光子顯微系統的小型化與高通量化，此類技術有望從基礎研究走向臨床病理診斷，例如術中神經束定位或神經移植效果評估。
聲明：本文僅用作學術目的。
Miller MQ, Hernández IC, Chacko JV, Minderler S, Jowett N. Two-photon excitation fluorescent spectral and decay properties of retrograde neuronal tracer Fluoro-Gold. Sci Rep. 2021 Sep 10;11(1):18053.
DOI:10.1038/s41598-021-97562-3.
