產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Ø 碧云天2005年底最新推出的質(zhì)粒中量抽提試劑盒(Plasmid Midi Preparation Kit)是目前世界上最先進(jìn)的中抽試劑盒之一。

本產(chǎn)品采用了一種新型的離子交換柱。在特定條件下，使質(zhì)粒能在離心過(guò)柱的瞬間，結(jié)合到質(zhì)粒純化柱上，在一定條件下又能
將質(zhì)粒充分洗脫，從而實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的快速純化。無(wú)需酚氯仿抽提，無(wú)需酒精沉淀，12個(gè)樣品只需不足60分鐘即可完成。

Ø 改進(jìn)了整個(gè)質(zhì)粒抽提系統(tǒng)，使本試劑盒的抽提方式更加便捷，抽提質(zhì)量有了進(jìn)一步提高。

Ø 質(zhì)粒純化柱的容量約為50微克。每個(gè)純化柱可用于抽提5-10毫升用LB培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌。抽提所得質(zhì)粒的OD值一般在1.80左右。所得質(zhì)粒量會(huì)受質(zhì)�？截悢�(shù)等因素影響，OD值也會(huì)因菌種不同等原因而略有波動(dòng)。

Ø 兩步過(guò)柱純化，使質(zhì)粒純度進(jìn)一步提高，達(dá)到轉(zhuǎn)細(xì)胞級(jí)要求。


Ø 無(wú)需高速冷凍離心機(jī)，只需普通臺(tái)式高速離心機(jī)。所有操作均可在1.5ml離心管中完成。

Ø 由本試劑盒所得質(zhì)粒可直接用于轉(zhuǎn)細(xì)胞，DNA測(cè)序，PCR，基于PCR的突變，體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)化細(xì)菌，內(nèi)切酶消化。 本試劑盒抽提


的含F(xiàn)irefly luciferase或Renila luciferase報(bào)告基因的質(zhì)粒，用Lipofectmine 2000或Fugene 6轉(zhuǎn)細(xì)胞，報(bào)告基因檢測(cè)

結(jié)果表明僅0.5微克受SV40啟動(dòng)子控制的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化12孔板內(nèi)的一孔原代貼壁細(xì)胞，總RLU值約為五百萬(wàn)，測(cè)定時(shí)間為10秒。
Ø 內(nèi)毒素(endotoxin)含量低。用對(duì)內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞轉(zhuǎn)染受內(nèi)毒素響應(yīng)的報(bào)告基因質(zhì)粒，與Qiagen極其昂貴的Endotoxin Free 大抽試劑盒相比，檢測(cè)結(jié)果完全一致。




包裝清單：



產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品名稱 包裝
D0018-1 溶液I (懸浮液) 45 ml
D0018-2 溶液II (裂解液) 45 ml
D0018-3 溶液III (結(jié)合液) 60 ml
D0018-4 溶液IV (洗滌液) 36ml (第一次使用前加入54ml無(wú)水乙醇)
D0018-5 溶液V (洗脫液) 15 ml
D0018-6 溶液VI (DNA純化結(jié)合液) 35 ml
D0018-7 RNase A (100mg/ml) 45微升
— 中抽質(zhì)粒純化柱 50個(gè)
— 廢液收集管 50個(gè)
— 說(shuō)明書 1份




保存條件：

室溫保存，一年有效。



注意事項(xiàng)：


Ø 第一次使用前把試劑盒提供的RNase A全部加入到溶液I(懸浮液)中，混勻，并在瓶上做好標(biāo)記，使用后4℃存放。
Ø 第一次使用前在溶液IV(洗滌液)中加入54ml無(wú)水乙醇，混勻，并在瓶上做好標(biāo)記。


Ø 溫度較低時(shí)，溶液II和溶液III可能會(huì)有沉淀產(chǎn)生。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，37℃水浴加熱溶解，混勻后使用。溶液II


請(qǐng)勿過(guò)分劇烈混勻，否則會(huì)產(chǎn)生大量氣泡。
Ø 溶液II使用完后，一定要蓋緊瓶蓋，防止被空氣中二氧化碳酸化。


Ø 溶液II有強(qiáng)堿性，溶液II和溶液III對(duì)人體都有刺激性， 操作時(shí)請(qǐng)小心，并注意適當(dāng)防護(hù)。


Ø 本試劑盒所有操作均在室溫進(jìn)行，操作時(shí)無(wú)需冰浴。所有離心也均在室溫進(jìn)行。

Ø 廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。


Ø 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。



使用說(shuō)明：

1. 取過(guò)夜菌至3個(gè)1.5毫升離心管中，5000g離心1分鐘收集細(xì)菌沉淀，棄上清。再重復(fù)一次，每管共收集3毫升過(guò)夜菌沉


淀。
通常大腸桿菌宜用LB培養(yǎng)過(guò)夜(16小時(shí)左右)至OD值為2-4。建議5000g(通常為5000rpm左右)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分，

則適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或離心速度過(guò)快會(huì)使沉淀過(guò)于緊密，不利于加入溶液I后散開沉淀。直接倒掉上清，再倒入約
1.5毫升菌液并重復(fù)上述操作，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。如果細(xì)菌密度明顯偏低，可考慮使用更多菌
液，再重復(fù)上述操作1-2次。對(duì)于高拷貝質(zhì)粒所用菌量一般不能超過(guò)5毫升，對(duì)于低拷貝質(zhì)粒所用菌量一般不能超過(guò)10毫升。過(guò)
量的細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的裂解不充分。

2. 每管加入250微升溶液I，重懸細(xì)菌沉淀。確保沉淀完全散開，無(wú)可見細(xì)菌團(tuán)塊。


確認(rèn)溶液I中已經(jīng)添加了RNase A。最高速度vortex 5-10秒或更長(zhǎng)時(shí)間，懸起沉淀。一定要充分混勻，對(duì)著光亮處觀察應(yīng)呈均

勻的懸濁液，無(wú)明顯細(xì)菌團(tuán)塊或絮塊。如果沒有vortex，可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開或用手指把沉淀彈開。
3. 每管加入250微升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明。

切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會(huì)導(dǎo)致基因組DNA斷裂，易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒被基因組DNA污染。顛倒4-6次后，溶液應(yīng)變


得透明，無(wú)團(tuán)塊或絮狀物。如果加入溶液I后細(xì)菌沒有完全散開，那么顛倒4-6次后，可能還會(huì)有團(tuán)塊或絮狀物。遇到有少量團(tuán)

塊或絮狀物產(chǎn)生的情況，可以增加顛倒次數(shù)3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時(shí)間不可超過(guò)5分鐘。

4. 每管加入350微升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產(chǎn)生。


切勿vortex！顛倒次數(shù)也不宜過(guò)多，否則易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒的質(zhì)量下降。


5. 最高速(13,000rpm左右)室溫離心10分鐘。


離心后會(huì)產(chǎn)生白色沉淀。離心時(shí)準(zhǔn)備好下一步需使用的質(zhì)粒純化柱，廢液收集管，并在純化柱上做好標(biāo)記。

6. 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)。最高速離心30-60秒，倒棄收集管內(nèi)液體。再重復(fù)兩次，使三管

質(zhì)粒結(jié)合于同一純化柱上。
質(zhì)粒倒入質(zhì)粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。


7. 在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入750微升溶液IV，最高速離心30-60秒，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。


加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。


8. 再最高速離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發(fā)。



注意：倒棄收集管內(nèi)液體后再離心，才能徹底去除微量的溶液IV。 微量的溶液IV會(huì)影響質(zhì)粒的質(zhì)量。


9. 將質(zhì)粒純化柱置于1.5毫升離心管上，加入120微升溶液V至管內(nèi)柱面上，放置1分鐘。

溶液V需要直接加至管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液V沾在管壁上，一定要震動(dòng)離心管，使液體滑落到管


底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或MiliQ級(jí)純水替代溶液V，但是水的pH應(yīng)不小于6.5。溶液V加入后放置時(shí)間稍長(zhǎng)，對(duì)

于增加質(zhì)粒產(chǎn)量會(huì)略有幫助。
10. 最高速離心1分鐘，所得液體中加入600微升溶液VI，混勻后加到原質(zhì)粒純化柱內(nèi)。

加入溶液VI后必須混勻！可vortex或顛倒混勻，混勻后切勿離心。

11. 最高速離心30-60秒，倒棄收集管內(nèi)液體。

12. 在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入750微升溶液IV，最高速離心30-60秒，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。

加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。

13. 最高速再離心1分鐘 ，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發(fā)。
注意： 倒棄收集管內(nèi)液體后再離心，才能徹底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會(huì)影響質(zhì)粒的質(zhì)量。

14. 將質(zhì)粒純化柱置于1.5毫升離心管上，加入120微升溶液V至管內(nèi)柱面上，放置1分鐘。

用1.5ml離心管作為收集管。溶液V需要直接加至管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液V沾在管壁上，一定要震

動(dòng)管子，使液體滑落到管底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或MiliQ級(jí)純水替代溶液V，但是水的pH應(yīng)不小于6.5。溶液V
加入后放置時(shí)間稍長(zhǎng)，對(duì)于增加質(zhì)粒產(chǎn)量會(huì)略有幫助。如想得到較高濃度的質(zhì)粒，可以加入80微升溶液V洗脫。
15. 最高速離心1分鐘，所得液體即為轉(zhuǎn)細(xì)胞級(jí)超純質(zhì)粒。


通常所得質(zhì)粒濃度為0.1-0.3mg/ml。如果想得到高濃度的質(zhì)粒，可以采用常規(guī)的乙醇沉淀的方法濃縮質(zhì)粒。