產品簡介：

Ø 碧云天生產的基因定點突變試劑盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)可以用于點突變，多個鄰近密碼子的突變，單個或
多個鄰近密碼子的缺失(deletion)或插入(insertion)。

Ø 本試劑盒是一個利用目前最新的基因點突變技術設計而成的試劑盒。
只需通過基于PCR的突變質粒的合成，和基于DpnI的模板質粒的消化，
轉化培養以及后續的酶切或測序鑒定，即可得到預期的突變質粒(參考
圖1)。累計操作時間不足2小時即可完成基因的定點突變。
Ø 參考圖1，使用本試劑盒時需要先設計長度通常為30個堿基以上的互補
的兩個引物，在引物中含有預期的突變位點。然后以待突變的質粒為
模板，用這兩個引物進行PCR擴增反應。這樣可以產生含有預期的突變
位點的雙鏈質粒，但這個雙鏈質粒中有兩個nick位點。待突變的質粒
通常來源于大腸桿菌等細菌，在細菌中會被甲基化修飾，而在體外通
過PCR擴增得到的質粒不會被甲基化。這樣用甲基化酶Dpn I處理，可
以消化掉待突變的質粒模板，而使通過PCR擴增出來的含有突變位點的
質粒被選擇性地保留下來。這樣把Dpn I處理過的產物轉化細菌后，質
粒中有兩個nick位點可以被大腸桿菌修復，得到的克隆就會含有預期
的突變質粒了。
Ø 本試劑盒提供了DH5α甘油菌，可以用于感受態細菌的制備。
Ø 本試劑盒共可以進行十次基因定點突變反應。 圖1. 基因定點突變試劑盒原理圖



包裝清單：

Pfu DNA Polymerase 10 微升
Reaction Buffer (10X) 100 微升
dNTP Mix (2.5mM each) 50 微升
Dpn I 10 微升
DH5α甘油菌 200 微升
Nuclease-Free Water 1 毫升
說明書 1 份




保存條件：

-20℃保存，一年有效。



注意事項：

Ø 需自行配制LB液體培養基和LB平板以用于細菌的培養。


Ø 需自行設計和合成用于基因定點突變的引物。需自備用于細菌轉化的試劑。


Ø 使用本試劑盒前請先閱讀后面的常見問題。
Ø 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。


使用說明：

1.
引物設計：


用于特定基因突變的引物需要單獨設計，請參考如下一些基本原則進行設計：
(1) 共需設計兩條互補的引物。可以先集中設計一條，然后就可以得到互補的另一條引物。
(2) 引物的長度通常為25-45個堿基。
(3) 引物中突變位點任何一側都必須滿足4X(GC堿基數)＋2X(AT堿基數)≥45。但引物也不宜過長，否則通常會形成非常穩定的

二級結構。通常把突變位點兩側的堿基數控制在15個左右，且使兩側按照上述計算得到的數值相近。

例如引物為agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag，其中藍色的aag為突變位點，則

左側：4X(GC堿基數)＋2X(AT堿基數)＝4X8＋2X7＝46≥45
右側：4X(GC堿基數)＋2X(AT堿基數) ＝4X8＋2X8＝48≥45
(4) 在可能的情況下，盡量把引物的GC含量控制在40％-60％。
(5) 在可能的情況下，盡量使引物不要產生非常穩定的二級結構和引物二聚體。二級結構和二聚體可以通過一些軟件進行分析。
(6) 最好使用經過PAGE純化的引物或更高純度的引物。
2. 引物的配制：

如果合成得到的一個引物A的量是20nmol，另外一個互補引物B的量是19nmol。在引物A中加入200微升水，配制成濃度為100μM
的溶液，在引物B中加入190微升水也配制成濃度為100μM。吸取20微升100μM引物A和20微升100μM引物B到一新的離心管中，
再加入160微升水，混勻后即可得到可以直接用于基因定點突變反應的引物(10μM each)。
3. 待突變模板質粒的選擇：

選擇GC含量在40-55％的待突變模板質粒，并且每一個50bp左右的局部GC含量最好也不超過70%。如果GC含量過高，請先把目的
基因克隆到其它合適的載體上，再進行基因定點突變反應。另外目的基因GC含量最好也在40-55％的范圍，并且每一個50bp左右
的局部GC含量最好也不超過70%。如果目的基因GC含量過高，而突變位點不在高GC含量區域，可以先把該基因的不含高GC含量的
一個區域克隆出來，進行定點突變，然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果必須使用高GC含量的質粒模板，或者有局部高
GC含量的質粒模板，請另外使用專門用于高GC含量模板的PCR反應試劑。
必須使用從dam+的大腸桿菌(這類菌中質粒可以被甲基化)中抽提得到的質粒用于基因定點突變。常用的大部分大腸桿菌都是dam+
的，包括DH5α、JM109等。
4. 基因定點突變反應：

(1) 如下設置基因定點突變反應體系：
Nuclease-Free Water ?微升
Reaction Buffer(10X) 5微升
引物(10μM each) 2微升
dNTP Mix(2.5mM each) 4微升
待突變模板質粒(0.5μg) ?微升
總體積 49微升

按照上述順序依次加入各種試劑。在上述反應體系中，根據待突變模板質粒的量，計算出需加入的Nuclease-Free Water的量，
使總體積為49微升。適當混勻后，加入1微升Pfu DNA Polymerase，混勻。如果用的PCR儀沒有熱蓋，在反應體系上加入一滴礦
物油(mineral oil)以防止蒸發。
(2) 按照如下參數設置PCR儀：
步驟 循環數 溫度 時間 說明
1 1 95℃ 1分鐘 最初變性
2 18 95℃ 40秒 變性
60℃ 1分鐘 退火
68℃ 1分鐘/kb 延伸
3 1 72℃ 10分鐘 延伸、補全
4 1 4℃ 長時間保持 暫時存放

說明：上面表格中1分鐘/kb表示，如果待突變的質粒為6kb，那么68℃的延伸時間為6分鐘。
5. Dpn I消化：
PCR反應后，直接在PCR反應體系中加入1微升Dpn I，混勻后37℃孵育1小時。37℃孵育可以在PCR儀上進行，也可以在水浴鍋中

進行。Dpn I消化完畢后可以直接用于轉化，或者-20℃保存備用。
6. 轉化、挑克隆鑒定：
感受態細菌的轉化效率必須至少在107以上，否則很難得到克隆。根據所使用的感受態細菌，加入盡量多的經過Dpn I消化后的突

變產物用于轉化。通常每100微升感受態細菌中可以加入5-10微升經過Dpn I消化后的突變產物。按照所使用的感受態細菌的操
作方法進行操作，在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉化后的細菌，全部涂布到含有適當抗生素的平板上，培養過夜。通
常會得到50個以下的克隆。如果發現克隆有上千個，那么肯定是有什么地方出了問題。
對于得到的克隆，可以先挑克隆小抽酶切鑒定。以確認得到的質粒的大小和質粒中插入片斷的大小與預期結果是否相符。

取3-5個酶切鑒定正確的克隆去測序，以最終確認得到的克隆是否是預期的突變克隆。通常大約每2個克隆中會得到一個預期的突
變克隆。但有時也可能會因為隨機因素，會測序了3-5個克隆才得到一個預期的突變克隆。

常見問題：

請參考本試劑盒的說明書。




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