產(chǎn)品簡介：
 本Protein A Agarose為進口分裝，主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗體的純化。
 Protein A Agarose適合于免疫沉淀mouse IgG2a, IgG2b, IgA, rabbit IgG, 以及human IgG1, IgG2和IgG4。
 Protein A共價交聯(lián)到4% agarose beads上，2ml Protein A Agarose中共含有約2.5mg重組的Protein A。2 ml Protein A Agarose共可以結(jié)合約17mg human IgG。
 Protein A Agarose配制在TBS溶液中，含0.05%疊氮鈉，2ml中共含有0.5ml Agarose beads。
 本Protein A Agarose如果用于常規(guī)的免疫沉淀，可以免疫沉淀100次。
包裝清單：
產(chǎn)品編號 產(chǎn)品名稱 包裝
P2006 Protein A Agarose 1ml/管，共2管
— 說明書 1份
保存條件：
4℃保存，一年有效。
注意事項：
 請勿冷凍保存本產(chǎn)品。
 Protein A Agarose使用前一定要充分重懸，即充分顛倒若干次使混合均勻。
 從蛋白樣品收集開始，所有步驟中蛋白樣品都必須在4℃或冰上操作。
 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：
A. 蛋白樣品的準(zhǔn)備：
A1. 對于10厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次，然后加入500微升至2毫升細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。可以使用碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)或各種RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等進行細(xì)胞的裂解。
A2. 對于組織樣品參考貼壁細(xì)胞使用裂解液的比例進行裂解。
A3. 對于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細(xì)胞的裂解方法進行裂解。
注： 詳細(xì)的裂解方法參考不同裂解液的詳細(xì)使用方法。對于不同的培養(yǎng)器材，參考10厘米培養(yǎng)皿的裂解液的用量進行裂解。如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高，可以用裂解液或PBS適當(dāng)稀釋，如果蛋白樣品濃度過低，在以后的裂解過程中宜適當(dāng)減少裂解液的用量。
B. 去除非特異性結(jié)合(可選做)：
B1. 取200微升至1毫升蛋白樣品，蛋白量約為200微克至1毫克，加入約1微克和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG和20微升充分重懸的Protein A Agarose，4℃緩慢搖動30分鐘至2小時。
B2. 2500rpm(約1000g)離心5分鐘，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。
注： 所謂種屬相同的IgG是指，例如后續(xù)免疫沉淀時用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG，如無normal IgG可以加入其它不影響后續(xù)檢測的其它mouse IgG類型的抗體。通過和normal IgG和Protein A Agarose的孵育，可以充分降低非特異性的結(jié)合，降低背景。
C. 免疫沉淀：
C1. 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃緩慢搖動過夜。
C2. 再加入20微升充分重懸的Protein A Agarose，4℃緩慢搖動1-3個小時。(為方便后續(xù)的洗滌操作可以把加入充分重懸的Protein A Agarose的量調(diào)整為40微升。)
C3. 2500rpm(約1000g)離心5分鐘，或瞬時高速離心，小心吸除上清，注意寧可留下少量上清也不能吸掉Protein A Agarose。
C4. 用準(zhǔn)備蛋白樣品時的裂解液或PBS洗滌沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次為0.5-1毫升。洗滌時離心條件和吸除上清的要求同上面的步驟C3。
C5. 完成最后一次洗滌后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液Vortex重懸沉淀，瞬時高速離心把樣品離心至管底。
C6. 100℃或沸水浴處理3-5分鐘，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳，暫時不用的樣品可以-20℃保存。
2. 免疫共沉淀：
參考免疫沉淀的方法進行，但免疫共沉淀(co-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳。
3. 抗體純化：
A. 準(zhǔn)備工作：
A1. 用0.45微米或0.2微米孔徑的濾膜過濾所用的溶液。
A2. 所有的溶液必須用超聲等方法脫氣(degas)。
A3. 選擇適當(dāng)?shù)募兓�柱，用適當(dāng)量的Protein A Agarose裝填純化柱。
A4. 用10-20倍柱體積的TBS洗滌并平衡純化柱，流速可以用恒流泵控制為1ml/min。如無恒流泵，也可以完全依靠重力洗滌并平衡純化柱。
B. 抗體純化：
B1. 把含有待純化的抗體上樣到純化柱。
B2. 待純化的抗體過柱后，用10-20倍柱體積的TBS洗滌，以去除未結(jié)合和非特異性結(jié)合的蛋白。洗滌是否完全可以通過測定280nm的吸光度進行確定。
B3. 洗滌完后，用10ml 50mM glycine， pH2.7作為洗脫液，洗脫結(jié)合的抗體。某些抗體和Protein A的結(jié)合能力很強，在pH2.7時洗脫效果不太理想，可以使用50mM glycine， pH1.9作為洗脫液。分管收集洗脫下的抗體，根據(jù)蛋白濃度或后續(xù)的檢測效果確定洗脫峰在哪幾個收集管中。
C. 純化柱的再生：
C1. 用10-20倍柱體積的TBS洗滌純化柱，使純化柱達到中性的pH。
C2. 用含0.02%疊氮鈉的TBS來保存再生的純化柱。