產品簡介：
 碧云天的細胞凋亡－DNA Ladder抽提試劑盒(離心柱式)(Apoptosis, DNA Ladder Extraction Kit with Spin Column)是目前最先進的DNA Ladder抽提試劑盒之一。本試劑盒是針對細胞凋亡過程中產生的核小體間DNA鏈斷裂而設計的。可以非常有效地抽提最小片斷為180-200bp的DNA ladder，同時又可以抽提到最大50kb左右的基因組DNA。
 DNA ladder也稱DNA fragmentation，是細胞凋亡的一個重要指標。通常觀察到DNA ladder，就可以判定細胞發生了凋亡。
 樣品首先被蛋白酶K消化，隨后加入適合DNA結合到純化柱上的緩沖液，然后加入到純化柱內。通過高速離心，使DNA在穿過純化柱的瞬間，結合到純化柱上，隨后通過兩次洗滌去除各種雜質，最后通過洗脫液把DNA洗脫下來。整個過程無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，樣品裂解后僅需約15分鐘即可完成。
 通過DNA純化柱方式抽提DNA ladder比用傳統的酚氯仿抽提酒精沉淀方法更加便捷，小片斷DNA不容易損失。
 本試劑盒每次最多可以抽提20mg組織或200-350萬個培養細胞。樣品用量過多，反而會影響抽提效果。
 試劑盒提供了RNase A，可以獲得不含RNA的高純度總DNA，排除了RNA對DNA ladder觀察造成的干擾。
 純化柱對于DNA的最大容量約為30微克。通常每200萬Hela細胞或500萬淋巴細胞可以抽提得到15-25微克總DNA，每25mg肝、腦、腎組織可以抽提得到10-30微克總DNA，每25毫克心、肺組織可以抽提得到5-10微克總DNA，每10mg脾組織可以抽提得到5-30微克總DNA。樣品的用量請勿超過純化柱的容量，樣品用量最好能保持在純化柱容量的70%或以下。當然過少的樣品也不利于檢測到DNA ladder。
 對于培養細胞的凋亡檢測，通常6孔板一個孔的細胞就足夠用于DNA ladder的抽提和檢測。
 本試劑盒可以抽提50個樣品。
包裝清單：
產品編號 產品名稱 包裝
C0008-1 樣品裂解液A 10ml
C0008-2 樣品裂解液B 11ml
C0008-3 洗滌液I 21ml (第一次使用前加入7ml無水乙醇)
C0008-4 洗滌液II 16ml (第一次使用前加入24ml無水乙醇)
C0008-5 洗脫液 22ml
C0008-6 蛋白酶K 1.1ml
C0008-7 RNase A 220μl
— DNA純化柱 50個
— 廢液收集管 50個
— 說明書 1份
保存條件：
蛋白酶K-20℃保存，其余均室溫保存。一年有效。蛋白酶K室溫(15-25℃)存放一周，活力無明顯下降。
注意事項：
 溫度較低時樣品裂解液A或樣品裂解液B中可能會有沉淀產生，屬正常現象。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，55℃水浴孵育使沉淀溶解，混勻后使用。
 第一次使用前洗滌液I需添加7ml無水乙醇，洗滌液II需添加24ml無水乙醇，混勻，并在瓶上做好標記。
 本試劑盒需使用55℃或70℃水浴，請提前作好準備。
 除特別說明外，每次Vortex應控制在5-10秒左右。
 本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行。
 廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。
 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 從培養的動物細胞中抽提并檢測DNA ladder
a． 收集約100萬個細胞，離心沉淀后重懸于200微升PBS中。
需自備PBS。如果使用凍存的細胞沉淀，先把細胞沉淀結凍，并輕輕彈散，然后再加入PBS。
b． 加入4微升RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置2分鐘。
c． 加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻。
d． 加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
加入樣品裂解液B后必須立即Vortex混勻。不可把蛋白酶K直接和樣品裂解液B混合。
e． 加入200微升無水乙醇，Vortex混勻。
加入乙醇后必須充分混勻，否則會嚴重影響抽提效果。加入乙醇后可能產生白色沉淀，屬正常現象，后續步驟中必須把白色沉淀和溶液全部轉移到純化柱內。
f． 把步驟e中的混合物加入到DNA純化柱內。≥6000g (約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
注意：必須把沉淀全部轉移到DNA純化柱內，否則會嚴重影響抽提效果！
g． 加入500微升洗滌液I，≥6000g (約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
h． 加入600微升洗滌液II，≥18000g (約≥12000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內液體。
進行本步驟前需把純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
i． 再≥18000g (約≥12000rpm)離心1分鐘，以去除殘留的乙醇。
不可把步驟h的離心時間延長而省略本步驟。倒棄廢液后再離心可以確保充分去除殘留的乙醇。
j． 將DNA純化柱置于一潔凈的1.5ml離心管上，加入50-100微升洗脫液。室溫放置1-3分鐘。≥12000rpm離心1分鐘。所得液體即為純化得到的總DNA。
洗脫液需要直接加至純化柱管內柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果有必要，可以使用去離子水或TE進行洗脫。使用較小體積的洗脫液可以使獲得的總DNA的濃度較高，但洗脫下來的DNA量相對較少。
k． 取部分抽提得到的DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳分析。如果細胞發生凋亡，即可觀察到典型的DNA ladder。電泳時一定要注意換用新鮮配制的電泳液，DNA凝膠也要用新鮮配制的電泳液配制并新鮮配制后使用。電泳時為獲取最佳的電泳效果使ladder充分分開，電泳速度宜適當慢一些，凝膠宜適當長一些，而加樣孔宜更加扁平一些。選取適當較薄的梳齒，往往會獲得更好的ladder電泳效果。
2. 從動物組織中抽提并檢測DNA ladder
a． 取不超過25mg的組織(脾不超過10mg)，剪切成盡可能小的碎片，加入180微升樣品裂解液A。
請勿使用過多的樣品，過多的樣品會導致抽提效果下降。較小的組織碎片會使裂解速度加快，裂解效果提高。新鮮或凍存的組織均可，但固定過的組織請參考后續的其它步驟進行。
b． 加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期間可以偶爾取出樣品Votex以加快裂解速度。裂解的時間因組織不同而有所不同，通常可在1-3小時內完成。為方便起見，可以直接裂解過夜，裂解過夜對抽提效果無任何負面影響。組織完全裂解后可以呈粘稠狀，但不應該呈可把DNA純化柱堵住的凝膠狀。如果消化過夜仍呈凝膠狀，說明樣品用量過多，作為補救措施，可以把整個反應體系放大一倍。
c． 加入4微升RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置2分鐘。
d． 最高速劇烈Vortex 15秒。加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
加入樣品裂解液B后需立即Vortex混勻。加入樣品裂解液B后可能會產生白色沉淀，但大多數情況在70℃孵育后會溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不會干擾后續實驗。有些組織例如肺、脾，在加入樣品裂解液B后可能會形成凝膠狀物，此時需劇烈晃動或Vortex樣品，以盡量破壞凝膠狀物。
e． 轉步驟1.e，后續步驟同“從培養的動物細胞中抽提總DNA”1.e起的步驟。