產品簡介：
 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用FITC標記的重組人Annexin V來檢測細胞凋亡時出現在細胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細胞凋亡檢測試劑盒。可以使用流式細胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設備進行檢測。
 Annexin是一類廣泛分布于真核細胞細胞漿內鈣離子依賴的磷酯結合蛋白，參與細胞內的信號轉導。但僅Annexin V被報道可以調控一些PKC的活性。
 Annexin V選擇性結合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細胞膜內側，即與細胞漿相鄰的一側。在細胞發生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細胞表面，即細胞膜外側。磷酯酰絲氨酸暴露到細胞表面后會促進凝血和炎癥反應。而Annexin V和外翻到細胞表面的磷酯酰絲氨酸結合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應活性。
 用帶有綠色熒光的熒光探針FITC標記的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式細胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細胞凋亡的重要特征。
 本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞，呈現紅色熒光。對于壞死細胞，由于細胞膜的完整性已經喪失，Annexin V-FITC可以進入到細胞漿內，與位于細胞膜內側的磷酯酰絲氨酸結合，從而也使壞死細胞呈現紅色熒光。
 綜上所述，參考右圖，用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色后，正常的活細胞不被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(右圖左下角)；凋亡早期的細胞僅被Annexin V-FITC染色，碘化丙啶染色呈陰性(右圖右下角)；壞死細胞和凋亡晚期的細胞可以同時被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(右圖右上角)。右圖左上角出現的是許可范圍內的檢測誤差。
包裝清單：
產品編號 產品名稱 包裝
C1062-1 Annexin V-FITC 100μl
C1062-2 Annexin V-FITC結合液(4X) 3ml
C1062-3 碘化丙啶染色液 220μl
— 說明書 1份
保存條件：
4℃保存，Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需避光保存，半年有效。為長期保存，可以把Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液適當分裝后-20℃保存，Annexin V-FITC結合液可以直接-20℃保存。
注意事項：
 如果有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。
 染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。
 熒光物質均易發生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
 需自備PBS。另外，使用前Annexin V-FITC結合液(4X)必須稀釋成1X。
 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
準備工作：取適量Annexin V-FITC結合液(4X)，用MilliQ級純水或雙蒸水稀釋至1X。例如1ml Annexin V-FITC結合液(4X)中加入3ml MilliQ級純水或雙蒸水，混勻后即為Annexin V-FITC結合液(1X)。Annexin V-FITC結合液(1X)如果有多余可以-20℃保存，以備下次使用。
1. 對于懸浮細胞：
A. 在進行完細胞凋亡刺激后，1000g (約1000-2000rpm)離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細胞的作用，可以保證后續Annexin V-FITC的結合.
B. 取5-10萬重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結合液(1X)輕輕重懸細胞。
C. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
D. 室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進行避光。
E. 1000g離心5分鐘，棄上清，加入190μl Annexin V-FITC結合液(1X)輕輕重懸細胞。
F. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。
G. 隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-FITC結合液(1X)輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
2. 對于貼壁細胞：
A. 把細胞培養液吸出至一合適離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，用胰酶細胞消化液(可含有EDTA)消化細胞。
B. 細胞消化下來后，加入步驟2A中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離心管內，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。。
C. 取5-10萬重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結合液(1X)輕輕重懸細胞。
D. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
E. 室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進行避光。
F. 1000g離心5分鐘，棄上清，加入190μl Annexin V-FITC結合液(1X)輕輕重懸細胞。
G. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。
H. 隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-FITC結合液(1X)輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
3. 對于貼壁細胞的原位熒光顯微鏡檢測：
注：本方法的優點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
A. (選做)如果條件許可，把細胞培養于24孔板、48孔板或96孔板內。在凋亡誘導結束后，用可以對多孔板進行離心的離心機1000g離心5分鐘。
B. 吸除細胞培養液，加入PBS洗滌一次。(如果條件許可，在吸除PBS前1000g離心5分鐘。)
C. 加入195μl Annexin V-FITC結合液(1X)。
D. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
E. 室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進行避光。
F. 吸除溶液，加入190μl Annexin V-FITC結合液(1X)輕輕重懸細胞。(如果條件許可，在吸除溶液前1000g離心5分鐘。)
G. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。
H. 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。