產(chǎn)品簡介：
 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用FITC標(biāo)記的重組人Annexin V來檢測細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。可以使用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。
 Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報(bào)道可以調(diào)控一些PKC的活性。
 Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。
 用帶有綠色熒光的熒光探針FITC標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。
 本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-FITC可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。
 綜上所述，參考右圖，用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色后，正常的活細(xì)胞不被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(右圖左下角)；凋亡早期的細(xì)胞僅被Annexin V-FITC染色，碘化丙啶染色呈陰性(右圖右下角)；壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞可以同時(shí)被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(右圖右上角)。右圖左上角出現(xiàn)的是許可范圍內(nèi)的檢測誤差。
包裝清單：
產(chǎn)品編號 產(chǎn)品名稱 包裝
C1063-1 Annexin V-FITC 250μl
C1063-2 Annexin V-FITC結(jié)合液(4X) 6.5ml
C1063-3 碘化丙啶染色液 550μl
— 說明書 1份
保存條件：
4℃保存，Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需避光保存，半年有效。為長期保存，可以把Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液適當(dāng)分裝后-20℃保存，Annexin V-FITC結(jié)合液可以直接-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
 如果有細(xì)菌或真菌污染，會嚴(yán)重影響檢測效果。
 染色后宜盡快檢測，時(shí)間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
 熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時(shí)，盡量縮短觀察時(shí)間，同時(shí)在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
 需自備PBS。另外，使用前Annexin V-FITC結(jié)合液(4X)必須稀釋成1X。
 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
準(zhǔn)備工作：取適量Annexin V-FITC結(jié)合液(4X)，用MilliQ級純水或雙蒸水稀釋至1X。例如1ml Annexin V-FITC結(jié)合液(4X)中加入3ml MilliQ級純水或雙蒸水，混勻后即為Annexin V-FITC結(jié)合液(1X)。Annexin V-FITC結(jié)合液(1X)如果有多余可以-20℃保存，以備下次使用。
1. 對于懸浮細(xì)胞：
A. 在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g (約1000-2000rpm)離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時(shí)也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-FITC的結(jié)合.
B. 取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液(1X)輕輕重懸細(xì)胞。
C. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
D. 室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。
E. 1000g離心5分鐘，棄上清，加入190μl Annexin V-FITC結(jié)合液(1X)輕輕重懸細(xì)胞。
F. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。
G. 隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液(1X)輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
2. 對于貼壁細(xì)胞：
A. 把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一適當(dāng)?shù)碾x心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，用胰酶細(xì)胞消化液(可含有EDTA)消化細(xì)胞。
B. 細(xì)胞消化下來后，加入步驟2A中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。。
C. 取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液(1X)輕輕重懸細(xì)胞。
D. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
E. 室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。
F. 1000g離心5分鐘，棄上清，加入190μl Annexin V-FITC結(jié)合液(1X)輕輕重懸細(xì)胞。
G. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。
H. 隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液(1X)輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
3. 對于貼壁細(xì)胞的原位熒光顯微鏡檢測：
注：本方法的優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
A. (選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對多孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000g離心5分鐘。
B. 吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。(如果條件許可，在吸除PBS前1000g離心5分鐘。)
C. 加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液(1X)。
D. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
E. 室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。
F. 吸除溶液，加入190μl Annexin V-FITC結(jié)合液(1X)輕輕重懸細(xì)胞。(如果條件許可，在吸除溶液前1000g離心5分鐘。)
G. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。
H. 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。