產品簡介：

Ø 碧云天生產的一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)為您提供了一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對于經過固定和洗滌的細胞或組織，只要經過一步染色反應，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測到凋亡細胞。
Ø 細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發現180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上熒光素標記的dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，這就是TUNEL(TdT--mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細胞凋亡的原理。
Ø 本試劑盒有如下優點。(1)高靈敏度：可以在單細胞水平檢測到細胞凋亡，同時由于凋亡早期就有DNA斷裂，可以檢測到早期的細胞凋亡。(2)特異性：TUNEL檢測時通常更容易標記凋亡細胞，而不容易標記壞死細胞。(3)快速：僅需約1-2個小時即可完成。(4)方便：只需一步染色反應，洗滌后即可觀察，不必使用二抗等進行多步操作。(5)應用范圍廣：可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可以檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。
Ø TUNEL法特異性檢測細胞凋亡時產生的DNA斷裂，但不會檢測出射線等誘導的DNA斷裂(和細胞凋亡時的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和壞死區分開，另一方面也不會把射線等誘導發生DNA斷裂的非凋亡細胞判斷為凋亡細胞。
Ø 極少數細胞凋亡時沒有DNA斷裂，此時不適用TUNEL法檢測。在個別類型的壞死細胞中也發現TUNEL檢測呈陽性。在需要嚴格判斷細胞凋亡的情況下，最好同時檢測多個凋亡指標。
Ø 本試劑盒足夠檢測50個樣品。





包裝清單：

產品編號
產品名稱
包裝

C1088-1
TdT酶
100微升

C1088-2
熒光標記液
1.2毫升/管，共2管

C1088-3
TdT酶稀釋液(選用)
1毫升

—
說明書
1份






保存條件：

-20℃保存，熒光標記液需避光保存。



注意事項：

Ø 需自備用于洗滌細胞的PBS或HBSS，用于封片的抗熒光淬滅封片液(P0126)，用于固定的4%多聚甲醛或向碧云天訂購免疫染色固定液(P0098)，同時需自備含0.1％ Triton X-100的PBS或向碧云天訂購免疫染色洗滌液(P0106)。
Ø 如果用于石蠟切片的檢測，需自備蛋白酶K，二甲苯。蛋白酶K(ST533)可以向碧云天訂購。
Ø 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。



使用說明：


1. 對于貼壁細胞或細胞涂片：
a. PBS或HBSS洗滌一次。
b. 如果細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。
c. 用4%多聚甲醛或碧云天生產的免疫染色固定液(P0098)固定細胞30-60分鐘。
d. 用PBS或HBSS洗滌一次。
e. 加入含0.1％ Triton X-100的PBS或碧云天生產的免疫染色洗滌液(P0106)，冰浴孵育2分鐘。
f. 轉步驟5。
2. 對于懸浮細胞或細胞懸液：
a. 收集細胞(不超過200萬細胞)，PBS或HBSS洗滌一次。
b. 用4%多聚甲醛或碧云天生產的免疫染色固定液(P0098)固定細胞30-60分鐘。為防止細胞聚集成團，宜在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動的同時進行固定。
c. 用PBS或HBSS洗滌一次。
d. 用含0.1％ Triton X-100的PBS或碧云天生產的免疫染色洗滌液(P0106)重懸細胞，冰浴孵育2分鐘。
e. 轉步驟5。

3. 對于石蠟切片：
a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。
b. 滴加20mg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的最佳作用溫度和時間需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續的標記反應。
d. 轉步驟5。
4. 對于冷凍切片：
a. 用4%多聚甲醛或碧云天生產的免疫染色固定液(P0098)固定細胞30-60分鐘。
b. PBS或HBSS洗滌2次，每次10分鐘。
c. 加入含0.1％ Triton X-100的PBS或碧云天生產的免疫染色洗滌液(P0106)，冰浴孵育2分鐘。
d. 轉步驟5。
5. 配制TUNEL檢測液：
參考下表配制適當量的TUNEL檢測液，需充分混勻。注意：配制好的TUNEL檢測液必須一次使用完畢，不能凍存。

1個樣品
5個樣品
10個樣品

TdT酶
2微升
10微升
20微升

熒光標記液
48微升
240微升
480微升

TUNE檢測液
50微升
250微升
500微升


6. 對于貼壁細胞、細胞涂片或組織切片：
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 在樣品上加50微升TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。注意：孵育時需注意在周圍用浸足水的紙或藥棉等保持濕潤，以盡量減少TUNEL檢測液的蒸發。
c. PBS或HBSS洗滌3次。
d. 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長范圍為450-500nm，發射波長范圍為515-565nm(綠色熒光)。
7. 對于懸浮細胞或細胞懸液：
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 加入50微升TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。
c. PBS或HBSS洗滌2次。
d. 用250-500微升PBS或HBSS懸浮。
e. 此時可以用流式細胞儀進行檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長范圍為450-500nm，發射波長范圍為515-565nm(綠色熒光)。

常見問題:
1. 出現非特異性熒光標記。
a. 有些細胞或組織，例如平滑肌細胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導致出現非特異性的熒光標記。解決方法是，取細胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導致假陽性。
b. 使用了不適當的固定液，例如一些酸性固定液，導致出現假陽性。建議采用推薦的固定液。
c. TUNEL檢測反應時間過長，或TUNEL檢測反應過程中反應液滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現非特異性熒光。注意控制反應時間，并確保TUNEL檢測反應液能很好地覆蓋樣品。
2. 熒光背景很高。
a. 支原體污染。請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。支原體染色檢測試劑盒(C0296)可以向碧云天訂購。
b. 高速分裂和增殖的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA斷裂。
c. TUNEL反應過強。可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當日使用。
d. 紅細胞中血紅蛋白導致的自發熒光產生嚴重干擾。此時宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒。
3. 標記效率低。
a. 使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低。
b. 固定時間過長，導致交聯程度過高。此時宜減少固定時間。
c. 熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴重淬滅。解決方法是需注意避光操作。
d. 碘化丙啶雙染時，如果碘化丙啶染色過深會導致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發產生的熒光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5微克/毫升碘化丙啶。



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