產品簡介：

Ø Caspase 4 活性檢測試劑盒(Caspase 4 Activity Assay Kit)是采用分光光度法檢測細胞或組織裂解液中Caspase 4酶活性或純化的Caspase 4酶活性的試劑盒。
Ø Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一個在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 4有時被寫作caspase-4或caspase4，可以和Apaf-1相互作用并參與細胞色素c導致的caspase 3激活。Caspase 4也可以和caspase 14相互作用。
Ø 本Caspase 4 活性檢測試劑盒是基于Caspase 4可以催化底物Ac-LEVD-pNA(acetyl-Leu-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)產生黃色的pNA(p-nitroaniline)，從而可以通過測定吸光度來檢測Caspase 4的活性。pNA在405nm附近有強吸收。
Ø 試劑盒中提供了Caspase 4催化產生的黃色產物pNA，可以作為定量Caspase 4酶活性的標準品。
Ø 本試劑盒用酶標儀檢測或容量不超過100微升的分光光度檢測杯檢測時，除標準曲線外可以檢測100個樣品。





包裝清單：

產品編號
產品名稱
包裝

C1122-1
裂解液
30ml

C1122-2
檢測緩沖液
10ml/瓶，共2瓶

C1122-3
Ac-LEVD-pNA(2mM)
0.2ml/管，共5管

C1122-4
pNA(10mM)
1ml

—
說明書
1份






保存條件：

-20℃保存，Ac-LEVD-pNA和pNA需避光保存。



注意事項：

Ø 須自備可以測定A405或A400的酶標儀或容量不超過100微升的分光光度檢測杯及相應分光光度計。優先考慮測定A405，如有困難可以測定A400。
Ø Ac-LEVD-pNA需盡量避免反復凍融，請注意適當分裝。
Ø 測定蛋白濃度需BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012)，可向碧云天訂購。
Ø pNA(中文名為4-硝基苯胺)有毒，請注意小心防護。
Ø 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。



使用說明：


1. 準備工作：
A. 裂解液溶解后混勻并置于冰浴上備用。
B. 檢測緩沖液溶解后混勻并置于冰浴上備用。
2. 測定pNA標準曲線：
A. 標準品稀釋液的配制：按照每0.9ml檢測緩沖液加入0.1ml裂解液的比例配制適量的標準品稀釋液。
B. 把試劑盒提供的pNA(10mM)用標準品稀釋液稀釋為0、10、20、50、100和200μM，作為標準品。
C. 每個濃度取100微升用酶標儀進行檢測，或取適當量用容量不超過100微升的分光光度檢測杯進行檢測，測定A405。
D. 每一個標準品的A405減去不含pNA的空白對照的A405計算出實際的因pNA而導致的吸光度，并制作出pNA濃度相當于A405的標準曲線。

3. 樣品的收集：
A. 對于懸浮細胞：把沒有誘導凋亡的對照樣品和誘導凋亡的樣品，600g 4℃離心5分鐘收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量沒有細胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬細胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15分鐘。下轉步驟3D。
B. 對于貼壁細胞：吸取細胞培養液，備用。用胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的細胞培養液中。600g 4℃離心5分鐘收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量沒有細胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬細胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15分鐘。下轉步驟3D。
C. 對于組織樣品：按照每200萬細胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。然后把勻漿液轉移到1.5ml離心管中，冰浴再裂解5分鐘。
D. 4℃ 16,000-20,000g離心10-15分鐘。
E. 把上清轉移到冰浴預冷的離心管中。
F. 立即測定caspase 4的酶活性或-70℃保存樣品。同時可以取少量樣品用BCA法測定蛋白濃度，盡量使蛋白濃度達到1-3mg/ml，相當于每10微升待測樣品中含有10-30微克蛋白。如果細胞較小，可以適當增加細胞的用量。
4. caspase 4酶活性的檢測：
A. 取出pNA和適量的Ac-LEVD-pNA(2mM)，置于冰浴上備用。
B. 如下設置反應體系：

空白對照
樣品

檢測緩沖液
90微升
80微升

待測樣品
0微升
10微升

Ac-LEVD-pNA(2mM)
10微升
10微升

總體積
100微升
100微升


注意：在設置反應體系時先加檢測緩沖液，再加待測樣品，適當混勻，注意避免在混勻時產生氣泡。隨后再加入10微升 Ac-LEVD-pNA(2mM)。
C. 加入Ac-LEVD-pNA(2mM)后混勻，注意避免在混勻時產生氣泡。37℃孵育60-120分鐘。發現顏色變化比較明顯時即可測定A405。如果顏色變化不明顯，可以適當延長孵育時間，甚至可以孵育過夜。
D. 樣品的A405扣除空白對照的A405，即為樣品中caspase 4催化產生的pNA產生的吸光度。通過同步驟1中獲得的標準曲線的對比就可以計算出樣品中催化產生了多少量的pNA。
E. caspase 4酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-LEVD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個酶活力單位定義為當底物飽和時，在37℃可以剪切1nmol Ac-LEVD-pNA產生1nmol pNA的caspase 4的酶量。這樣就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的caspase 4。說明：在本試劑盒的檢測體系中，底物的起始濃度為0.2mM，此時底物是飽和的，對于許多樣品而言在37℃孵育2個小時以內底物都是飽和的；對于樣品中caspase 4酶活力特別高的情況，須用裂解液適當稀釋樣品后再進行測定。
F. 用BCA法檢測待測樣品中的蛋白濃度(由于裂解液中含有較高濃度的CHAPS，不適合采用Bradford法進行蛋白濃度測定)。這樣就可以計算出一個樣品單位重量蛋白中所含的caspase 4的酶活力單位。

常見問題:
1. 測定出的A405過低：
A. 樣品中蛋白含量太低，裂解樣品時需設法使樣品中的蛋白濃度接近1-3mg/ml。
B. 樣品中激活的caspase水平很低。首先確認凋亡現象是否明顯，如果凋亡比較明顯并且確認該caspase是可以被激活的，可以適當調節誘導細胞凋亡的時間，希望能找到一個caspase激活比較強的時間點，這樣就可以檢測出該caspase的激活。可以作一時間曲線，例如誘導凋亡0、2、4、8、16和24小時，或0、1、2、4、8和16小時，或0、1、2、4、6和8小時等。具體的誘導凋亡時間需根據具體情況而定。
C. 通過上述優化后A405還是比較低，或濃縮樣品或做時間曲線比較困難，可以在測定樣品時加大樣品的用量，最多可達40微升。
假設每次測定樣品的用量為x微升，則：
C1.此時標準品稀釋液需按如下方法配制：按照x微升裂解液加入檢測緩沖液至最終體積為100微升的比例配制適量的標準品稀釋液。例如樣品用量為40微升，則按照40微升裂解液加入60微升檢測緩沖液，即0.4毫升裂解液加入0.6毫升檢測緩沖液的比例配制標準品稀釋液。其余標準曲線的測定方法同上面的使用說明所述。
C2.此時如下設置反應體系：

空白對照
樣品

檢測緩沖液
90微升
(90-x)微升

待測樣品
0微升
x微升

Ac-LEVD-pNA(2mM)
10微升
10微升

總體積
100微升
100微升


說明：其中x不超過40，其余檢測方法同上面的使用說明所述。