產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Ø Caspase 9 活性檢測(cè)試劑盒(Caspase 9 Activity Assay Kit)是采用分光光度法檢測(cè)細(xì)胞或組織裂解液中Caspase 9酶活性或純化的Caspase 9酶活性的試劑盒。
Ø Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一個(gè)在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 9也稱ICE-LAP6或Mch6，有時(shí)被寫作caspase-9或caspase9，是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中比較上游的一個(gè)caspase。線粒體釋放細(xì)胞色素c以后，caspase 9可以和細(xì)胞色素c以及Apaf1形成復(fù)合物，同時(shí)被激活。激活的caspase 9可以激活細(xì)胞凋亡的最關(guān)鍵酶caspase 3，從而促進(jìn)后續(xù)的細(xì)胞凋亡信號(hào)。Caspase 9的激活可以通過磷酸化進(jìn)行調(diào)控。
Ø 本Caspase 9 活性檢測(cè)試劑盒是基于Caspase 9可以催化底物Ac-LEHD-pNA(acetyl-Leu-Glu-His-Asp p-nitroanilide)產(chǎn)生黃色的pNA(p-nitroaniline)，從而可以通過測(cè)定吸光度來檢測(cè)Caspase 9的活性。pNA在405nm附近有強(qiáng)吸收。
Ø 試劑盒中提供了Caspase 9催化產(chǎn)生的黃色產(chǎn)物pNA，可以作為定量Caspase 9酶活性的標(biāo)準(zhǔn)品。
Ø 本試劑盒用酶標(biāo)儀檢測(cè)或容量不超過100微升的分光光度檢測(cè)杯檢測(cè)時(shí)，除標(biāo)準(zhǔn)曲線外可以檢測(cè)20個(gè)樣品。





包裝清單：

產(chǎn)品編號(hào)
產(chǎn)品名稱
包裝

C1157-1
裂解液
8ml

C1157-2
檢測(cè)緩沖液
8ml

C1157-3
Ac-LEHD-pNA(2mM)
0.2ml

C1157-4
pNA(10mM)
0.2ml

—
說明書
1份






保存條件：

-20℃保存，Ac-LEHD-pNA和pNA需避光保存。



注意事項(xiàng)：

Ø 須自備可以測(cè)定A405或A400的酶標(biāo)儀或容量不超過100微升的分光光度檢測(cè)杯及相應(yīng)分光光度計(jì)。優(yōu)先考慮測(cè)定A405，如有困難可以測(cè)定A400。
Ø Ac-LEHD-pNA需盡量避免反復(fù)凍融，請(qǐng)注意適當(dāng)分裝。
Ø 測(cè)定蛋白濃度需BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012)，可向碧云天訂購。
Ø pNA(中文名為4-硝基苯胺)有毒，請(qǐng)注意小心防護(hù)。
Ø 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。



使用說明：


1. 準(zhǔn)備工作：
A. 裂解液溶解后混勻并置于冰浴上備用。
B. 檢測(cè)緩沖液溶解后混勻并置于冰浴上備用。
2. 測(cè)定pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線：
A. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制：按照每0.9ml檢測(cè)緩沖液加入0.1ml裂解液的比例配制適量的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。
B. 把試劑盒提供的pNA(10mM)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋為0、10、20、50、100和200μM，作為標(biāo)準(zhǔn)品。
C. 每個(gè)濃度取100微升用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，或取適當(dāng)量用容量不超過100微升的分光光度檢測(cè)杯進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定A405。
D. 每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的A405減去不含pNA的空白對(duì)照的A405計(jì)算出實(shí)際的因pNA而導(dǎo)致的吸光度，并制作出pNA濃度相當(dāng)于A405的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 樣品的收集：
A. 對(duì)于懸浮細(xì)胞：把沒有誘導(dǎo)凋亡的對(duì)照樣品和誘導(dǎo)凋亡的樣品，600g 4℃離心5分鐘收集細(xì)胞，小心吸除上清，同時(shí)確保盡量沒有細(xì)胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬細(xì)胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15分鐘。下轉(zhuǎn)步驟3D。
B. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，備用。用胰酶消化貼壁細(xì)胞，并收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)液中。600g 4℃離心5分鐘收集細(xì)胞，小心吸除上清，同時(shí)確保盡量沒有細(xì)胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬細(xì)胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15分鐘。下轉(zhuǎn)步驟3D。
C. 對(duì)于組織樣品：按照每200萬細(xì)胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。然后把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，冰浴再裂解5分鐘。
D. 4℃ 16,000-20,000g離心10-15分鐘。
E. 把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。
F. 立即測(cè)定Caspase 9的酶活性或-70℃保存樣品。同時(shí)可以取少量樣品用BCA法測(cè)定蛋白濃度，盡量使蛋白濃度達(dá)到1-3mg/ml，相當(dāng)于每10微升待測(cè)樣品中含有10-30微克蛋白。如果細(xì)胞較小，可以適當(dāng)增加細(xì)胞的用量。
4. Caspase 9酶活性的檢測(cè)：
A. 取出pNA和適量的Ac-LEHD-pNA(2mM)，置于冰浴上備用。
B. 如下設(shè)置反應(yīng)體系：

空白對(duì)照
樣品

檢測(cè)緩沖液
90微升
80微升

待測(cè)樣品
0微升
10微升

Ac-LEHD-pNA(2mM)
10微升
10微升

總體積
100微升
100微升


注意：在設(shè)置反應(yīng)體系時(shí)先加檢測(cè)緩沖液，再加待測(cè)樣品，適當(dāng)混勻，注意避免在混勻時(shí)產(chǎn)生氣泡。隨后再加入10微升 Ac-LEHD-pNA(2mM)。
C. 加入Ac-LEHD-pNA(2mM)后混勻，注意避免在混勻時(shí)產(chǎn)生氣泡。37℃孵育60-120分鐘。發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)即可測(cè)定A405。如果顏色變化不明顯，可以適當(dāng)延長孵育時(shí)間，甚至可以孵育過夜。
D. 樣品的A405扣除空白對(duì)照的A405，即為樣品中Caspase 9催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度。通過同步驟1中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比就可以計(jì)算出樣品中催化產(chǎn)生了多少量的pNA。
E. Caspase 9酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-LEHD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個(gè)酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí)，在37℃可以剪切1nmol Ac-LEHD-pNA產(chǎn)生1nmol pNA的Caspase 9的酶量。這樣就可以計(jì)算出樣品中含有多少個(gè)酶活力單位的Caspase 9。說明：在本試劑盒的檢測(cè)體系中，底物的起始濃度為0.2mM，此時(shí)底物是飽和的，對(duì)于許多樣品而言在37℃孵育2個(gè)小時(shí)以內(nèi)底物都是飽和的；對(duì)于樣品中Caspase 9酶活力特別高的情況，須用裂解液適當(dāng)稀釋樣品后再進(jìn)行測(cè)定。
F. 用BCA法檢測(cè)待測(cè)樣品中的蛋白濃度(由于裂解液中含有較高濃度的CHAPS，不適合采用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定)。這樣就可以計(jì)算出一個(gè)樣品單位重量蛋白中所含的Caspase 9的酶活力單位。

常見問題:
1. 測(cè)定出的A405過低：
A. 樣品中蛋白含量太低，裂解樣品時(shí)需設(shè)法使樣品中的蛋白濃度接近1-3mg/ml。
B. 樣品中激活的caspase水平很低。首先確認(rèn)凋亡現(xiàn)象是否明顯，如果凋亡比較明顯并且確認(rèn)該caspase是可以被激活的，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的時(shí)間，希望能找到一個(gè)caspase激活比較強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)，這樣就可以檢測(cè)出該caspase的激活。可以作一時(shí)間曲線，例如誘導(dǎo)凋亡0、2、4、8、16和24小時(shí)，或0、1、2、4、8和16小時(shí)，或0、1、2、4、6和8小時(shí)等。具體的誘導(dǎo)凋亡時(shí)間需根據(jù)具體情況而定。
C. 通過上述優(yōu)化后A405還是比較低，或濃縮樣品或做時(shí)間曲線比較困難，可以在測(cè)定樣品時(shí)加大樣品的用量，最多可達(dá)40微升。
假設(shè)每次測(cè)定樣品的用量為x微升，則：
C1.此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液需按如下方法配制：按照x微升裂解液加入檢測(cè)緩沖液至最終體積為100微升的比例配制適量的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。例如樣品用量為40微升，則按照40微升裂解液加入60微升檢測(cè)緩沖液，即0.4毫升裂解液加入0.6毫升檢測(cè)緩沖液的比例配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。其余標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法同上面的使用說明所述。
C2.此時(shí)如下設(shè)置反應(yīng)體系：

空白對(duì)照
樣品

檢測(cè)緩沖液
90微升
(90-x)微升

待測(cè)樣品
0微升
x微升

Ac-LEHD-pNA(2mM)
10微升
10微升

總體積
100微升
100微升


說明：其中x不超過40，其余檢測(cè)方法同上面的使用說明所述。