產品簡介：

Ø 生物素3’末端DNA標記試劑盒(Biotin 3’End DNA Labeling Kit)是一種通過Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)把生物素標記的dUTP添加到DNA 3’末端的試劑盒。通常DNA的3’末端被標記后不會干擾雜交反應，也不會干擾基于序列特異性蛋白結合的EMSA檢測；因此生物素標記的DNA探針可以用于常規的Northern、Southern、EMSA(即gel shift)以及colony hybridization或原位雜交等。
Ø Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)可以在不依賴于模板的情況下催化在DNA的3’-OH端加上dNTP的反應。關于TdT催化雙鏈DNA末端加dNTP的反應效率，3’端突出的雙鏈DNA要比平端或3’端縮進的雙鏈DNA高很多。TdT催化單鏈DNA末端加dNTP的反應效率要比雙鏈DNA高很多。在適當的條件下，TdT也可以催化RNA 3’末端加NTP的反應。
Ø 本試劑盒適合標記純化的單鏈DNA，如果用于標記EMSA探針，可以在單鏈標記后再進行退火。
Ø 本試劑盒中提供了已經用生物素標記好的Biotin-Control Oligo，可以用作檢測DNA標記效率的對照。
Ø 如果每個標記反應的探針量為5pmol，本試劑盒可以用于20個標記反應。


包裝清單：

產品編號
產品名稱
包裝

D3106-1
TdT Buffer(5X)
250微升

D3106-2
TdT(10U/微升)
20微升

D3106-3
Biotin-11-dUTP(5μM)
100微升

D3106-4
Biotin-Control Oligo(0.4μM)
100微升

D3106-5
Ultrapure water
1毫升

D3106-6
探針標記終止液
200微升

D3106-7
TE
15毫升

—
說明書
1份





保存條件：

-20℃保存。



注意事項：

Ø 需自備用于檢測探針標記效率的硝酸纖維素膜(NC膜)或帶正電荷尼龍膜，以及用于生物素檢測的相關試劑。硝酸纖維素膜 (FFN06/FFN09)可以向碧云天訂購。
Ø 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。


使用說明：

1. 準備工作：
A. 取出TdT Buffer(5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上備用。
B. 取出待標記的DNA探針，用水稀釋至1微摩爾/升，并置于冰浴上備用。
2. DNA探針的標記：
A. 如下設置反應體系：

Ultrapure water
29微升

TdT Buffer(5X)
10微升

待標記探針(1μM)
5微升

Biotin-11-dUTP(5μM)
5微升

TdT(10U/微升)
1微升

總體積
50微升



B. 用槍輕輕吹打混勻，切勿vortex。37℃孵育30分鐘。
C. 加入2.5微升探針標記終止液，輕輕混勻終止反應。
3. TdT的去除：
A. 探針標記反應終止后，加入52.5微升氯仿-異戊醇，vortex使有機相和水相充分混合以抽提TdT(說明：靜止后有機相和水相會很快分層)。
B. 12000-14000g離心1-2分鐘。吸取上清備用。上清即為被生物素標記的DNA探針。
4. 探針的純化(選做)：
通常為實驗簡便起見，可以不必純化標記好的探針。有些時候，純化后的探針會改善后續實驗的結果。如需純化，可以按照如下步驟操作：
A. 對于100微升標記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。
B. -70℃至-80℃沉淀1小時，或-20℃沉淀過夜。
C. 4℃，12,000g-16,000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉淀。
D. 4℃，12,000g-16,000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。
E. 加入50微升TE，完全溶解沉淀。標記好的探針可以-20℃保存。
5. 生物素標記探針標記效率的檢測：
A. 取5微升Biotin-Control Oligo(0.4微摩爾/升)，加入196微升TE，混勻，稀釋成10nM Biotin-Control Oligo(作為標準品)。取出適量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀釋成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
B. 取3微升步驟3B所獲得的生物素標記的DNA探針(100nM)，加入27微升TE，混勻，稀釋成10nM生物素標記的探針(作為待測樣品)。取出適量的10nM生物素標記的探針，依次稀釋成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
C. 參考下面的表格，取一適當大小的硝酸纖維素膜(NC膜)或帶正電荷尼龍膜，在膜上做好相應標記。對于經過梯度稀釋的標準品和待測樣品，分別取2微升滴加到膜上。在膜上滴加標準品或待測樣品時，請注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一個濕的圓形小斑點。說明：如果條件許可，可以使用專門用于點雜交或狹縫雜交的設備進行探針標記效率的檢測，探針用量也參考下表，濃度可以稀釋50倍，而所用體積可以相應放大50倍至100微升。
探針濃度
10nM
5nM
2.5nM
1nM
0.5nM
0.25nM

Biotin-Control Oligo
2微升
2微升
2微升
2微升
2微升
2微升

生物素標記的探針
2微升
2微升
2微升
2微升
2微升
2微升

探針量
20fmol
10fmol
5fmol
2fmol
1fmol
0.5fmol


D. 滴加完所有的標準品和樣品后，將膜室溫晾干。
E. 用紫外交聯儀(UV-light cross-linker)選擇254nm紫外波長，120mJ/cm2，交聯30-45秒。如果沒有紫外交聯儀可以使用普通的手提式紫外燈(例如碧云天的手提紫外檢測儀，產品編號EUV002)，距離膜5-10厘米左右照射1-5分鐘。也可以使用超凈工作臺內的紫外燈，距離膜5-10厘米左右照射1-10分鐘。最佳的交聯時間可以使用標準品自行摸索。
F. 隨后可以立即采用各種生物素檢測試劑盒，檢測出樣品的生物素標記效率；也可以室溫存放數天直至進行后續檢測。
G. 如果最后采用的是ECL類試劑或其它類似試劑進行檢測，則可以對比樣品和標準品的灰度，從而計算出探針的標記效率。例如2fmol量的待測樣品探針的灰度和1fmol標準品的灰度相同，則說明探針的標記效率大致為50%，待測樣品中總探針的濃度約為1微摩爾/升，而實際被生物素標記的探針約為0.5微摩爾/升。探針的標記效率也可以通過建立標準曲線進行比較精確的計算。用于后續檢測時通常要求標記效率不低于30%。有文獻報道標記效率和3’末端的堿基無關，但和整個待標記探針的序列有關。由于在TdT的催化下可以在待標記探針的3’端加上多個Biotin標記的dUTP，因此有時會出現標記效率大于100%的情況。