產(chǎn)品簡介：

Ø Caspase 6 活性檢測試劑盒(Caspase 6 Activity Assay Kit)是采用分光光度法檢測細胞或組織裂解液中Caspase 6酶活性或純化的Caspase 6酶活性的試劑盒。
Ø Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一個在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 6也稱Mch-2，有時被寫作caspase-6或caspase6，最初從人的Jurkat細胞中被發(fā)現(xiàn)。Caspase 6的前體被granzyme B剪切后可以形成活化的caspase 6二聚體，而活化的caspase 6被發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)細胞凋亡。Caspase 6可以剪切PARP和keratin-18，也可以剪切細胞核核被膜上的關(guān)鍵組成蛋白Lamin A。Caspase家族中僅caspase 6可以剪切Lamin A。Caspase 6對于Lamin A的識別位點是VEID。本試劑盒利用了caspase 6對于VEID識別的特異性，設(shè)計了相應(yīng)的caspase 6特異的顯色底物Ac-VEID-pNA。
Ø 本Caspase 6 活性檢測試劑盒是基于Caspase 6可以催化底物Ac-VEID-pNA(acetyl-Val-Glu-Ilel-Asp p-nitroanilide)產(chǎn)生黃色的pNA(p-nitroaniline)，從而可以通過測定吸光度來檢測Caspase 6的活性。pNA在405nm附近有強吸收。
Ø 試劑盒中提供了Caspase 6催化產(chǎn)生的黃色產(chǎn)物pNA，可以作為定量Caspase 6酶活性的標(biāo)準(zhǔn)品。
Ø 本試劑盒用酶標(biāo)儀檢測或容量不超過100微升的分光光度檢測杯檢測時，除標(biāo)準(zhǔn)曲線外可以檢測100個樣品。





包裝清單：

產(chǎn)品編號
產(chǎn)品名稱
包裝

C1136-1
裂解液
30ml

C1136-2
檢測緩沖液
10ml/瓶，共2瓶

C1136-3
Ac-VEID-pNA(2mM)
0.2ml/管，共5管

C1136-4
pNA(10mM)
1ml

—
說明書
1份






保存條件：

-20℃保存，Ac-VEID-pNA和pNA需避光保存。



注意事項：

Ø 須自備可以測定A405或A400的酶標(biāo)儀或容量不超過100微升的分光光度檢測杯及相應(yīng)分光光度計。優(yōu)先考慮測定A405，如有困難可以測定A400。
Ø Ac-VEID-pNA需盡量避免反復(fù)凍融，請注意適當(dāng)分裝。
Ø 測定蛋白濃度需BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012)，可向碧云天訂購。
Ø pNA(中文名為4-硝基苯胺)有毒，請注意小心防護。
Ø 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。



使用說明：


1. 準(zhǔn)備工作：
A. 裂解液溶解后混勻并置于冰浴上備用。
B. 檢測緩沖液溶解后混勻并置于冰浴上備用。
2. 測定pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線：
A. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制：按照每0.9ml檢測緩沖液加入0.1ml裂解液的比例配制適量的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。
B. 把試劑盒提供的pNA(10mM)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋為0、10、20、50、100和200μM，作為標(biāo)準(zhǔn)品。
C. 每個濃度取100微升用酶標(biāo)儀進行檢測，或取適當(dāng)量用容量不超過100微升的分光光度檢測杯進行檢測，測定A405。
D. 每一個標(biāo)準(zhǔn)品的A405減去不含pNA的空白對照的A405計算出實際的因pNA而導(dǎo)致的吸光度，并制作出pNA濃度相當(dāng)于A405的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 樣品的收集：
A. 對于懸浮細胞：把沒有誘導(dǎo)凋亡的對照樣品和誘導(dǎo)凋亡的樣品，600g 4℃離心5分鐘收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量沒有細胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬細胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15分鐘。下轉(zhuǎn)步驟3D。
B. 對于貼壁細胞：吸取細胞培養(yǎng)液，備用。用胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的細胞培養(yǎng)液中。600g 4℃離心5分鐘收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量沒有細胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬細胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15分鐘。下轉(zhuǎn)步驟3D。
C. 對于組織樣品：按照每200萬細胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。然后把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，冰浴再裂解5分鐘。
D. 4℃ 16,000-20,000g離心10-15分鐘。
E. 把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。
F. 立即測定Caspase 6的酶活性或-70℃保存樣品。同時可以取少量樣品用BCA法測定蛋白濃度，盡量使蛋白濃度達到1-3mg/ml，相當(dāng)于每10微升待測樣品中含有10-30微克蛋白。如果細胞較小，可以適當(dāng)增加細胞的用量。
4. Caspase 6酶活性的檢測：
A. 取出pNA和適量的Ac-VEID-pNA(2mM)，置于冰浴上備用。
B. 如下設(shè)置反應(yīng)體系：

空白對照
樣品

檢測緩沖液
90微升
80微升

待測樣品
0微升
10微升

Ac-VEID-pNA(2mM)
10微升
10微升

總體積
100微升
100微升


注意：在設(shè)置反應(yīng)體系時先加檢測緩沖液，再加待測樣品，適當(dāng)混勻，注意避免在混勻時產(chǎn)生氣泡。隨后再加入10微升 Ac-VEID-pNA(2mM)。
C. 加入Ac-VEID-pNA(2mM)后混勻，注意避免在混勻時產(chǎn)生氣泡。37℃孵育60-120分鐘。發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時即可測定A405。如果顏色變化不明顯，可以適當(dāng)延長孵育時間，甚至可以孵育過夜。
D. 樣品的A405扣除空白對照的A405，即為樣品中Caspase 6催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度。通過同步驟1中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的對比就可以計算出樣品中催化產(chǎn)生了多少量的pNA。
E. Caspase 6酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-VEID-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r，在37℃可以剪切1nmol Ac-VEID-pNA產(chǎn)生1nmol pNA的Caspase 6的酶量。這樣就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的Caspase 6。說明：在本試劑盒的檢測體系中，底物的起始濃度為0.2mM，此時底物是飽和的，對于許多樣品而言在37℃孵育2個小時以內(nèi)底物都是飽和的；對于樣品中Caspase 6酶活力特別高的情況，須用裂解液適當(dāng)稀釋樣品后再進行測定。
F. 用BCA法檢測待測樣品中的蛋白濃度(由于裂解液中含有較高濃度的CHAPS，不適合采用Bradford法進行蛋白濃度測定)。這樣就可以計算出一個樣品單位重量蛋白中所含的Caspase 6的酶活力單位。

常見問題:
1. 測定出的A405過低：
A. 樣品中蛋白含量太低，裂解樣品時需設(shè)法使樣品中的蛋白濃度接近1-3mg/ml。
B. 樣品中激活的caspase水平很低。首先確認凋亡現(xiàn)象是否明顯，如果凋亡比較明顯并且確認該caspase是可以被激活的，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)細胞凋亡的時間，希望能找到一個caspase激活比較強的時間點，這樣就可以檢測出該caspase的激活。可以作一時間曲線，例如誘導(dǎo)凋亡0、2、4、8、16和24小時，或0、1、2、4、8和16小時，或0、1、2、4、6和8小時等。具體的誘導(dǎo)凋亡時間需根據(jù)具體情況而定。
C. 通過上述優(yōu)化后A405還是比較低，或濃縮樣品或做時間曲線比較困難，可以在測定樣品時加大樣品的用量，最多可達40微升。
假設(shè)每次測定樣品的用量為x微升，則：
C1.此時標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液需按如下方法配制：按照x微升裂解液加入檢測緩沖液至最終體積為100微升的比例配制適量的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。例如樣品用量為40微升，則按照40微升裂解液加入60微升檢測緩沖液，即0.4毫升裂解液加入0.6毫升檢測緩沖液的比例配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。其余標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法同上面的使用說明所述。
C2.此時如下設(shè)置反應(yīng)體系：

空白對照
樣品

檢測緩沖液
90微升
(90-x)微升

待測樣品
0微升
x微升

Ac-VEID-pNA(2mM)
10微升
10微升

總體積
100微升
100微升


說明：其中x不超過40，其余檢測方法同上面的使用說明所述。