產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Ø 化學(xué)發(fā)光法EMSA試劑盒(Chemiluminescent EMSA Kit)是一種通過(guò)Streptavidin-HRP及后續(xù)的ECL試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)Biotin標(biāo)記的EMSA探針的檢測(cè)試劑盒。同時(shí)本試劑盒也提供了EMSA檢測(cè)所需的結(jié)合緩沖液和上樣緩沖液，及一些關(guān)鍵的相關(guān)試劑，可以實(shí)現(xiàn)非同位素的EMSA檢測(cè)。
Ø 本試劑盒采用了高質(zhì)量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共價(jià)交聯(lián)的比例大于3，這樣比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate兩種試劑進(jìn)行檢測(cè)要更方便，并且靈敏度更高。
Ø 本試劑盒采用了非特異性結(jié)合比avidin更低的strepatavidin，使檢測(cè)結(jié)果背景更低靈敏度更高。
Ø 本試劑盒沒有提供生物素探針標(biāo)記相關(guān)的試劑，生物素標(biāo)記的EMSA探針的制備可以使用碧云天生產(chǎn)的EMSA探針生物素標(biāo)記試劑盒(GS008)。
Ø 本試劑盒可以用于100個(gè)蛋白和探針的結(jié)合反應(yīng)，并足夠檢測(cè)至少10塊有生物素標(biāo)記EMSA探針的膜。




包裝清單：

產(chǎn)品編號(hào)
產(chǎn)品名稱
包裝

GS009-1
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)
200微升

GS009-2
EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無(wú)色，10X)
200微升

GS009-3
EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍(lán)色，10X)
200微升

GS009-4
ECL Reagent A
55亳升

GS009-5
ECL Reagent B
55亳升

GS009-6
Streptavidin-HRP Conjugate
60微升

GS009-7
封閉液
380亳升

GS009-8
洗滌液(5X)
250亳升

GS009-9
檢測(cè)平衡液
250亳升

—
說(shuō)明書
1份





保存條件：

GS009-1至GS009-5在-20℃保存。GS009-6至GS009-9在4℃保存。



注意事項(xiàng)：

Ø 需自備帶正電荷尼龍膜或硝酸纖維素膜(NC膜)，以及凝膠電泳時(shí)所需的相關(guān)試劑。硝酸纖維素膜(FFN06/FFN09)可以向碧云天訂購(gòu)。

Ø 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。


使用說(shuō)明：

1. 探針的標(biāo)記：
使用碧云天生產(chǎn)的EMSA探針生物素標(biāo)記試劑盒(GS008)或其它合適的試劑盒進(jìn)行EMSA探針的生物素標(biāo)記。
2. 探針的純化和檢測(cè)：
通常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。有些時(shí)候，純化后的探針會(huì)改善EMSA的電泳結(jié)果。詳細(xì)的探針純化和探針的標(biāo)記效率的檢測(cè)請(qǐng)參考EMSA探針生物素標(biāo)記試劑盒的相關(guān)說(shuō)明。
3. EMSA膠的配制：

A. 準(zhǔn)備好倒膠的模具。可以使用常規(guī)的制備蛋白電泳膠的模具(例如BioRad的常規(guī)用于蛋白電泳的制膠裝置)，或其它適當(dāng)?shù)哪＞摺Ｗ詈眠x擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大EMSA膠的模具。制膠前必須把制膠模具沖洗干凈，需特別注意不能有SDS殘留。
B.
按照如下配方配制20ml 4％的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對(duì)結(jié)果影響不大)。

TBE buffer (10X)
1毫升
重蒸水
16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)
2毫升
80% 甘油
625微升
10% 過(guò)硫酸銨 (ammonium persulfate)
150微升
TEMED
10微升

(3) 按照上述順序加入各種試劑，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡，

并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。
4. EMSA結(jié)合反應(yīng)：

(1)
如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)：
陰性對(duì)照反應(yīng)：

Nuclease-Free Water
7微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)
2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子
0微升
標(biāo)記好的探針
1微升
總體積
10微升
樣品反應(yīng)：

Nuclease-Free Water
5微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)
2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子
2微升
標(biāo)記好的探針
1微升
總體積
10微升


探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：

Nuclease-Free Water
4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)
2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子
2微升
未標(biāo)記的探針 1微升
標(biāo)記好的探針
1微升
總體積
10微升
突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：

Nuclease-Free Water
4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)
2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子
2微升
未標(biāo)記的突變探針 1微升
標(biāo)記好的探針
1微升
總體積
10微升


Super-shift反應(yīng)：

Nuclease-Free Water
4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)
2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子
2微升
目的蛋白特異抗體
1微升
標(biāo)記好的探針
1微升
總體積
10微升


(2) 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25℃)放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探
針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鐘。
(3) 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無(wú)色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時(shí)候溴酚藍(lán)會(huì)影響蛋白和DNA的結(jié)合，建

議盡量使用無(wú)色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對(duì)于使用無(wú)色上樣緩沖液在上樣時(shí)感覺到無(wú)法上樣，可以在無(wú)色上樣
緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至可以觀察到藍(lán)顏色即可。

5. 電泳：

(1) 用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X
的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。
(2) 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液
(藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。
(3) 按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過(guò)30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩

沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。
6. 轉(zhuǎn)膜：
A. 取一和EMSA膠大小相近或略大的尼龍膜，剪角做好標(biāo)記，用0.5XTBE浸泡至少10分鐘。尼龍膜自始至終僅能使用鑷子夾取，并且僅可夾取不可能接觸樣品的邊角處。
B. 取兩片和尼龍膜大小相近或略大的濾紙，用0.5XTBE浸濕。
C. 把浸泡過(guò)的尼龍膜放置在一片浸濕的濾紙上，注意避免尼龍膜和濾紙間產(chǎn)生氣泡。
D. 非常小心地取出EMSA膠放置到尼龍膜上，注意確保膠和膜之間沒有氣泡。
E. 再把另外一片浸濕的濾紙放置到EMSA膠上，注意確保濾紙和膠之間沒有氣泡。
F. 采用Western時(shí)所使用的濕法電轉(zhuǎn)膜裝置或其它類似的電轉(zhuǎn)膜裝置，把EMSA膠上的探針、蛋白以及探針和蛋白的復(fù)合物等轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。對(duì)于大小約為10x8x0.1cm的EMSA膠，用BioRad的常用的Western轉(zhuǎn)膜裝置，電轉(zhuǎn)時(shí)可以設(shè)置為380mA(約100V)轉(zhuǎn)膜30-60分鐘。如果膠較厚，則需適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間。轉(zhuǎn)膜時(shí)需保持轉(zhuǎn)膜液的溫度較低，通常可以把電轉(zhuǎn)槽置于4℃冷庫(kù)或置于冰浴或冰水浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，這樣可以確保低溫。具體的電轉(zhuǎn)膜方法請(qǐng)參考電轉(zhuǎn)膜裝置的使用說(shuō)明。
G. 轉(zhuǎn)膜完畢后，小心取出尼龍膜，樣品面向上，放置在一干燥的濾紙上，輕輕吸掉下表面明顯的液體。立即進(jìn)入下一步的交聯(lián)步驟，不可使膜干掉。
7. 交聯(lián)：
A. 用紫外交聯(lián)儀(UV-light cross-linker)選擇254nm紫外波長(zhǎng)，120mJ/cm2，交聯(lián)45-60秒。如果沒有紫外交聯(lián)儀可以使用普通的手提式紫外燈(例如碧云天的手提紫外檢測(cè)儀，產(chǎn)品編號(hào)EUV002)，距離膜5-10厘米左右照射3-10分鐘。也可以使用超凈工作臺(tái)內(nèi)的紫外燈，距離膜5-10厘米左右照射3-15分鐘。最佳的交聯(lián)時(shí)間可以使用標(biāo)準(zhǔn)品自行摸索。
B. 交聯(lián)完畢后，可以直接進(jìn)入下一步檢測(cè)；也可以用保鮮膜包裹后在室溫干燥處存放3-5天，然后再進(jìn)入下一步檢測(cè)。
8. 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)生物素標(biāo)記的探針：
A. 37-50℃水浴溶解封閉液和洗滌液。
注意：封閉液和洗滌液必須完全溶解后方可使用，封閉液和洗滌液可以在室溫至50℃之間使用，但必須確保這兩種溶液中均無(wú)沉淀產(chǎn)生，在冬天需特別注意。
B. 取一合適的容器加入15ml封閉液，再放入交聯(lián)過(guò)的含有樣品的尼龍膜。在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動(dòng)15分鐘。
C. 取5微升Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封閉液中(1:3000稀釋)，混勻備用。
D. 去除用于尼龍膜封閉的封閉液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封閉液。在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動(dòng)15分鐘。
E. 取25ml洗滌液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ級(jí)純水，混勻配制成125ml洗滌液。
F. 將尼龍膜轉(zhuǎn)移至另一裝有15-20ml洗滌液的容器內(nèi)，漂洗1分鐘。
G. 去除洗滌液，加入15-20ml洗滌液，在側(cè)擺搖床或水平搖床緩慢上洗滌5分鐘。
H. 重復(fù)步驟G三次(共洗滌四次)，每次洗滌時(shí)間都約為5分鐘。
I. 將尼龍膜轉(zhuǎn)移至另一裝有20-25ml檢測(cè)平衡液的容器內(nèi)，在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動(dòng)5分鐘。
J. 取5ml ECL Reagent A和5ml ECL Reagent B混勻，配制成ECL Reagent工作液。注意：ECL Reagent工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。
說(shuō)明：從本步驟起操作方法和注意事項(xiàng)同Western實(shí)驗(yàn)的ECL檢測(cè)。
K. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過(guò)多液體。立即將膜的樣品面向上，放置到處于水平桌面上的潔凈容器內(nèi)或保鮮膜上。
L. 在尼龍膜的表面小心加上步驟J配制好的共10ml ECL Reagent工作液，使工作液完全覆蓋尼龍膜。室溫放置2-3分鐘。
M. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過(guò)多液體。將尼龍膜放在兩片保鮮膜或其它適當(dāng)?shù)耐腹獗∧ぶ虚g，并固定于壓片暗盒(也稱片夾)內(nèi)。
N. 用X光片壓片1-5分鐘。可以先壓片1分鐘，立即顯影定影，然后根據(jù)結(jié)果再調(diào)整壓片時(shí)間；也可以直接分別壓片30秒、1、3、5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，然后一起顯影定影觀察結(jié)果。