MeDIP-qPCR技術服務

    實時熒光定量PCR技術（Real-time Quantitative PCR）是在PCR反應體系當中加入熒光試劑，利用熒光信號積累實時檢測PCR的進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR能夠專一，靈敏，快速，高重復地精確定量起始模板的濃度。
    康成生物將實時定量PCR技術與MeDIP技術完美結合。首先通過MeDIP技術富集甲基化的DNA片段，然后利用實時定量PCR技術進行檢測，最后經過數據分析處理得到檢測的生物樣品中特定位點的甲基化水平的精確數值。

MeDIP-qPCR技術特點
• 高特異性，針對感興趣的基因啟動子或CpG島設計實時定量PCR引物
• 超寬的線性范圍，可跨越7個數量級
• 精確度高，重復性好
• 靈敏度高

康成生物MeDIP-qPCR技術服務流程
A. 將基因組DNA 超聲打斷成400bp-500bp片段
B. 加熱變性，并將變性后的單鏈DNA樣品分為兩份
C. 其中一份單鏈DNA樣品加入抗5’-甲基胞嘧啶抗體，另一份作為Total input DNA樣品
D. 使用親和層析分離C步樣品中的甲基化DNA片段的抗體復合物，樣品中其余的非甲基化DNA片段被洗脫。純化得到甲基化DNA片段（MeDNA-IP DNA）
E. 實時定量PCR檢測

實驗數據處理
•  Total input DNA樣品作為模板，用待測基因特異性引物進行qPCR檢測得到Ct (input)
•  MeDNA-IP DNA樣品作為模板進行檢測得到Ct (IP)
•  待測基因甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）的效率（MeDIP / Total input）可通過以下公式計算：
   %（MeDIP / Total input）= 2^[ Ct (input)- Ct (IP) ] X 100

康成客戶實例----MeDIP-qPCR
Quantitative detection of multiple gene promoter hypermethylation in tumor tissue, serum, and cerebrospinal fluid predicts prognosis of malignant gliomas. Neuro Oncol., 2010.
    研究人員利用MeDIP-qPCR技術檢測發現，在不同惡性神經膠質瘤病人的腫瘤組織，血清和腦脊髓液樣本中，MGMT, p16INK4a, TIMP-3,和 THBS1四個基因啟動子區域都發生了高甲基化，而且血清和腦脊髓液的DNA甲基化水平與腫瘤組織基本一致（見下圖）。通過與臨床生存數據關聯分析發現，MGMT, p16INK4a和THBS1的甲基化水平可以作為獨立的預測因子用于腫瘤的預后分析。因此血清或腦脊液中這些基因的甲基化有望成為新的腫瘤標志物，同時檢測這些基因的甲基化水平也為惡性膠質瘤病人的化療方案選擇和預后分析提供了新的理論依據。

上圖：MeDIP/Input值表示DNA甲基化水平的高低；圓圈代表不同的病人樣本；黑色短線是有效區分病人預后好和差的甲基化閾值。

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