產品簡介：

Ø 化學發光法EMSA試劑盒(Chemiluminescent EMSA Kit)是一種通過Streptavidin-HRP及后續的ECL試劑來實現化學發光檢測Biotin標記的EMSA探針的檢測試劑盒。同時本試劑盒也提供了EMSA檢測所需的結合緩沖液和上樣緩沖液，及一些關鍵的相關試劑，可以實現非同位素的EMSA檢測。
Ø 本試劑盒采用了高質量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共價交聯的比例大于3，這樣比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate兩種試劑進行檢測要更方便，并且靈敏度更高。
Ø 本試劑盒采用了非特異性結合比avidin更低的strepatavidin，使檢測結果背景更低靈敏度更高。
Ø 本試劑盒沒有提供生物素探針標記相關的試劑，生物素標記的EMSA探針的制備可以使用碧云天生產的EMSA探針生物素標記試劑盒(GS008)。
Ø 本試劑盒可以用于100個蛋白和探針的結合反應，并足夠檢測至少10塊有生物素標記EMSA探針的膜。




包裝清單：

產品編號
產品名稱
包裝

GS009-1
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X)
200微升

GS009-2
EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)
200微升

GS009-3
EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍色，10X)
200微升

GS009-4
ECL Reagent A
55亳升

GS009-5
ECL Reagent B
55亳升

GS009-6
Streptavidin-HRP Conjugate
60微升

GS009-7
封閉液
380亳升

GS009-8
洗滌液(5X)
250亳升

GS009-9
檢測平衡液
250亳升

—
說明書
1份





保存條件：

GS009-1至GS009-5在-20℃保存。GS009-6至GS009-9在4℃保存。



注意事項：

Ø 需自備帶正電荷尼龍膜或硝酸纖維素膜(NC膜)，以及凝膠電泳時所需的相關試劑。硝酸纖維素膜(FFN06/FFN09)可以向碧云天訂購。

Ø 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。


使用說明：

1. 探針的標記：
使用碧云天生產的EMSA探針生物素標記試劑盒(GS008)或其它合適的試劑盒進行EMSA探針的生物素標記。
2. 探針的純化和檢測：
通常為實驗簡便起見，可以不必純化標記好的探針。有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結果。詳細的探針純化和探針的標記效率的檢測請參考EMSA探針生物素標記試劑盒的相關說明。
3. EMSA膠的配制：

A. 準備好倒膠的模具。可以使用常規的制備蛋白電泳膠的模具(例如BioRad的常規用于蛋白電泳的制膠裝置)，或其它適當的模具。最好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續操作。為得到更好的結果，可以選擇可灌制較大EMSA膠的模具。制膠前必須把制膠模具沖洗干凈，需特別注意不能有SDS殘留。
B.
按照如下配方配制20ml 4％的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結果影響不大)。

TBE buffer (10X)
1毫升
重蒸水
16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)
2毫升
80% 甘油
625微升
10% 過硫酸銨 (ammonium persulfate)
150微升
TEMED
10微升

(3) 按照上述順序加入各種試劑，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產生氣泡，

并加上梳齒。如果發現非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理。
4. EMSA結合反應：

(1)
如下設置EMSA結合反應：
陰性對照反應：

Nuclease-Free Water
7微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X)
2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子
0微升
標記好的探針
1微升
總體積
10微升
樣品反應：

Nuclease-Free Water
5微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X)
2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子
2微升
標記好的探針
1微升
總體積
10微升


探針冷競爭反應：

Nuclease-Free Water
4微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X)
2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子
2微升
未標記的探針 1微升
標記好的探針
1微升
總體積
10微升
突變探針的冷競爭反應：

Nuclease-Free Water
4微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X)
2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子
2微升
未標記的突變探針 1微升
標記好的探針
1微升
總體積
10微升


Super-shift反應：

Nuclease-Free Water
4微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X)
2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子
2微升
目的蛋白特異抗體
1微升
標記好的探針
1微升
總體積
10微升


(2) 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25℃)放置10分鐘，從而消除可能發生的探
針和蛋白的非特異性結合，或者讓冷探針優先反應。然后加入標記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鐘。
(3) 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結合，建

議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣
緩沖液里面添加極少量的藍色的上樣緩沖液，至可以觀察到藍顏色即可。

5. 電泳：

(1) 用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預電泳10分鐘。預電泳的時候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X
的EMSA上樣緩沖液(藍色)，以觀察電壓是否正常進行。
(2) 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內。在多余的某個上樣孔內加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液
(藍色)，用于觀察電泳進行的情況。
(3) 按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩

沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。
6. 轉膜：
A. 取一和EMSA膠大小相近或略大的尼龍膜，剪角做好標記，用0.5XTBE浸泡至少10分鐘。尼龍膜自始至終僅能使用鑷子夾取，并且僅可夾取不可能接觸樣品的邊角處。
B. 取兩片和尼龍膜大小相近或略大的濾紙，用0.5XTBE浸濕。
C. 把浸泡過的尼龍膜放置在一片浸濕的濾紙上，注意避免尼龍膜和濾紙間產生氣泡。
D. 非常小心地取出EMSA膠放置到尼龍膜上，注意確保膠和膜之間沒有氣泡。
E. 再把另外一片浸濕的濾紙放置到EMSA膠上，注意確保濾紙和膠之間沒有氣泡。
F. 采用Western時所使用的濕法電轉膜裝置或其它類似的電轉膜裝置，把EMSA膠上的探針、蛋白以及探針和蛋白的復合物等轉移到尼龍膜上。對于大小約為10x8x0.1cm的EMSA膠，用BioRad的常用的Western轉膜裝置，電轉時可以設置為380mA(約100V)轉膜30-60分鐘。如果膠較厚，則需適當延長轉膜時間。轉膜時需保持轉膜液的溫度較低，通常可以把電轉槽置于4℃冷庫或置于冰浴或冰水浴中進行電轉，這樣可以確保低溫。具體的電轉膜方法請參考電轉膜裝置的使用說明。
G. 轉膜完畢后，小心取出尼龍膜，樣品面向上，放置在一干燥的濾紙上，輕輕吸掉下表面明顯的液體。立即進入下一步的交聯步驟，不可使膜干掉。
7. 交聯：
A. 用紫外交聯儀(UV-light cross-linker)選擇254nm紫外波長，120mJ/cm2，交聯45-60秒。如果沒有紫外交聯儀可以使用普通的手提式紫外燈(例如碧云天的手提紫外檢測儀，產品編號EUV002)，距離膜5-10厘米左右照射3-10分鐘。也可以使用超凈工作臺內的紫外燈，距離膜5-10厘米左右照射3-15分鐘。最佳的交聯時間可以使用標準品自行摸索。
B. 交聯完畢后，可以直接進入下一步檢測；也可以用保鮮膜包裹后在室溫干燥處存放3-5天，然后再進入下一步檢測。
8. 化學發光法檢測生物素標記的探針：
A. 37-50℃水浴溶解封閉液和洗滌液。
注意：封閉液和洗滌液必須完全溶解后方可使用，封閉液和洗滌液可以在室溫至50℃之間使用，但必須確保這兩種溶液中均無沉淀產生，在冬天需特別注意。
B. 取一合適的容器加入15ml封閉液，再放入交聯過的含有樣品的尼龍膜。在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。
C. 取5微升Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封閉液中(1:3000稀釋)，混勻備用。
D. 去除用于尼龍膜封閉的封閉液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封閉液。在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。
E. 取25ml洗滌液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ級純水，混勻配制成125ml洗滌液。
F. 將尼龍膜轉移至另一裝有15-20ml洗滌液的容器內，漂洗1分鐘。
G. 去除洗滌液，加入15-20ml洗滌液，在側擺搖床或水平搖床緩慢上洗滌5分鐘。
H. 重復步驟G三次(共洗滌四次)，每次洗滌時間都約為5分鐘。
I. 將尼龍膜轉移至另一裝有20-25ml檢測平衡液的容器內，在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動5分鐘。
J. 取5ml ECL Reagent A和5ml ECL Reagent B混勻，配制成ECL Reagent工作液。注意：ECL Reagent工作液必須現配現用。
說明：從本步驟起操作方法和注意事項同Western實驗的ECL檢測。
K. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。立即將膜的樣品面向上，放置到處于水平桌面上的潔凈容器內或保鮮膜上。
L. 在尼龍膜的表面小心加上步驟J配制好的共10ml ECL Reagent工作液，使工作液完全覆蓋尼龍膜。室溫放置2-3分鐘。
M. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。將尼龍膜放在兩片保鮮膜或其它適當的透光薄膜中間，并固定于壓片暗盒(也稱片夾)內。
N. 用X光片壓片1-5分鐘。可以先壓片1分鐘，立即顯影定影，然后根據結果再調整壓片時間；也可以直接分別壓片30秒、1、3、5分鐘或更長時間，然后一起顯影定影觀察結果。