nrStar™ tRNA Repertoire PCR芯片技術(shù)服務(wù)

    轉(zhuǎn)運RNA (tRNA) 是生物體內(nèi)分布最廣泛、含量最豐富的非編碼小RNA分子。它攜帶并轉(zhuǎn)運氨基酸，參與蛋白翻譯，是連接mRNA與蛋白質(zhì)的重要橋梁。細胞增殖、分化和凋亡等一系列生物學(xué)過程都伴隨著tRNA水平的變化。反之，tRNA表達譜的改變也會影響細胞發(fā)育過程中的命運抉擇。表達失調(diào)的tRNA可以促進腫瘤的發(fā)生和癌癥進程。另外，許多其它疾病比如II型糖尿病、亨廷頓癥以及HIV感染都出現(xiàn)了tRNA表達與分布紊亂。tRNA研究已逐漸成為生物學(xué)過程和疾病研究的重要組成部分。
   美國Arraystar公司是非編碼RNA研究最優(yōu)秀的產(chǎn)品服務(wù)提供商。近期Arraystar發(fā)布了市場上首款專注于tRNA研究的PCR芯片­— nrStar™ Human tRNA Repertoire PCR Array。該款芯片可同時檢測66個細胞核tRNA和22線粒體tRNA，覆蓋了tRNA權(quán)威數(shù)據(jù)庫GtRNAdb和tRNAdb中的所有反密碼子，方便客戶快速地進行tRNA表達譜分析，為下一步的密碼子偏好性、蛋白翻譯效率和準確性、細胞動力學(xué)以及病毒感染的細胞嗜性等研究提供重要線索，是進行tRNA研究必不可少的工具。為了保證數(shù)據(jù)可信度，芯片還包含了3個看家小RNA作為內(nèi)參，3個質(zhì)控對照RNA Spike-in、PCR陽性對照（PPC）和基因組DNA對照（GDC）,分別用于監(jiān)測cDNA合成質(zhì)量、PCR效率和基因組DNA污染。
   tRNA存在種類繁多的修飾，對其發(fā)揮功能十分關(guān)鍵。然而，這些修飾尤其是甲基化修飾會嚴重阻礙反轉(zhuǎn)錄的進行，導(dǎo)致cDNA合成終止或堿基錯配。為此，Arraystar專門開發(fā)了針對tRNA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (rtStar™ tRNA-optimized First-Strand Synthesis Kit)。該試劑盒采用了一種高效的RNA去甲基化酶AlkB，能夠有效地去除tRNA上的甲基化修飾，極大地提高cDNA合成質(zhì)量。與此試劑盒組合使用，研究人員能夠獲得更為真實可靠的tRNA表達變化，為研究蛋白質(zhì)組或tRNA來源片段（tRFs）提供重要信息。

nrStar™ Human tRNA Repertoire PCR 芯片產(chǎn)品列表

芯片特點
• 囊括GtRNAdb和tRNAdb數(shù)據(jù)庫中所有的細胞核與線粒體反密碼子
• 伴隨的去甲基化處理使得檢測結(jié)果更加真實可靠
• 所有引物均在多種細胞和組織中通過驗證
• 即拆即用型384孔板，幾小時內(nèi)便可得到結(jié)果

康成tRNA Repertoire PCR芯片服務(wù)實驗流程
1. RNA抽提與質(zhì)量檢測
    進行RNA常規(guī)抽提，使用NanoDrop ND-1000檢測RNA濃度和純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。詳細的樣品QC結(jié)果見Arraystar服務(wù)報告。
2. 去甲基化處理與cDNA合成
    每樣本取1.5 μg RNA，使用rtStar™ tRNA-optimized First-Strand Synthesis Kit (Cat# AS-FS-004, Arraystar) 試劑盒進行去甲基化處理和反轉(zhuǎn),合成cDNA第一鏈。詳細步驟參照Arraystar產(chǎn)品操作手冊。
3. Real-time PCR擴增
    將cDNA與 Arraystar SYBR Green qPCR Master Mix (Cat# AS-MR-005-5, Arraystar)混合，加入至384孔板中，在ABI 7900 PCR儀上進行Real-time PCR擴增。
4. 熔解曲線分析與原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出
    PCR擴增完成后，進行熔解曲線分析，使用PCR儀自帶軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)。出具Raw Data文件夾，包含原始Ct值、PCR擴增曲線圖和熔解曲線圖。

康成tRNA Repertoire PCR芯片服務(wù)數(shù)據(jù)分析流程
1. PCR芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控
    質(zhì)控參數(shù)：Ct(Blank)>35; Ct(GDC)>35; Ct(RNA Spike-in)<25; Ct (PPC) <25. 符合上述條件的樣本進入下一步分析。數(shù)據(jù)QC結(jié)果見Arraystar服務(wù)報告。
2. 數(shù)據(jù)校正與△Ct值計算
    板間校正：使用Ct(PPC)對不同PCR板進行板間校正。
    內(nèi)參校正與△Ct值計算：挑選最優(yōu)內(nèi)參，使用內(nèi)參均值計算△Ct值。
3. 差異倍數(shù)計算 (2^(-△△Ct))
    使用 △△Ct 方法計算不同樣品組之間的表達差異倍數(shù)。
4. P值計算
    對樣本組進行t檢驗，計算P值。
5. 其他常規(guī)數(shù)據(jù)分析
    散點圖分析；火山圖分析；TOP20表達上調(diào)和下調(diào)tRNA柱形圖分析
6. 提供服務(wù)報告與數(shù)據(jù)分析結(jié)果
   a. Arraystar服務(wù)報告（包括RNA樣本QC、qPCR數(shù)據(jù)QC和詳細實驗數(shù)據(jù)分析步驟）
   b. Excel芯片結(jié)果匯總表（包括tRNA列表，數(shù)據(jù)分析結(jié)果和各類圖表）
   c. Raw Data文件夾 (包含原始數(shù)據(jù)、擴增曲線圖和熔解曲線圖)

康成tRNA Repertoire PCR芯片服務(wù)部分數(shù)據(jù)分析結(jié)果展示 
1. 差異表達tRNA列表（默認篩選參數(shù)：差異倍數(shù)>1.5；P<0.05，客戶可指定篩選參數(shù)值）

2. 散點圖 (黑色斜線代表差異倍數(shù)為1，紅色斜線代表差異倍數(shù)為1.5)

3. 火山圖（黑色垂線代表差異倍數(shù)為1；粉色垂線代表上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)為1.5；藍色水平線代表P值為0.05）

4. TOP20表達上調(diào)tRNA柱狀圖

5. TOP20表達下調(diào)tRNA柱狀圖